Folin-酚法（Lowry法）最靈敏的蛋白質測定方法之一。過去此法是套用最廣泛的一種方法，由於其試劑乙的配製較為困難，近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。最早由Lowry確定了蛋白質濃度測定的基本步驟。以後在生物化學領域得到廣泛的套用。
基本介紹
- 中文名：Folin-酚法
- 別名：Lowry法
- 類型：蛋白質測定法是最靈敏的方法之一
- 補充：近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代
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實驗原理
這種蛋白質測定法是最靈敏的方法之一。過去此法是套用最廣泛的一種方法，由於其試劑乙的配製較為困難（可訂購），逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。
此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。這兩種顯色反應產生深藍色的原因是：在鹼性條件下，蛋白質中的肽鍵與銅結合生成複合物。 Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和色氨酸殘基還原，產生深藍色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，藍色深度與蛋白的量成正相關。
Folin—酚試劑法最早由Lowry確定了蛋白質濃度測定的基本步驟。以後在生物化學領域得到廣泛的套用。這個測定法的優點是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多。缺點是費時間較長，要精確控制操作時間，標準曲線也不是嚴格的直線形式，且專一性較差，干擾物質較多。對雙縮脲反應發生干擾的離子，同樣容易干擾folin-酚反應（Lowry反應）。而且對後者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩衝液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸納（1%），硝酸納（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對顯色無影響，但這些物質濃度高時，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉—氫氧化鈉溶液，即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色後會色淺，則必須提高碳酸鈉—氫氧化鈉溶液的濃度1~2倍。
進行測定時，加Folin—酚試劑時要特別小心，因為該試劑僅在酸性pH條件下穩定，但上述還原反應只在pH=10的情況下發生，故當Folin一酚試劑加到鹼性的銅—蛋白質溶液中時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑 被破壞之前，還原反應即能發生。
此法可檢測的最低蛋白質量達5μg。通常測定範圍是20～250μg。
試劑與器材
試劑
（1）試劑甲（A，B）：
（A） 10克 Na2CO3，2克 NaOH和0.25克酒石酸鉀鈉 （KNaC4H4O6·4H2O）。溶解於500毫升蒸餾水中。
（B） 0.5克硫酸銅（CuSO4·5H2O）溶解於100毫升蒸餾水中，每次使用前，將50份（A）與1份（B）混合，即為試劑甲。
（2）試劑乙：
（3）標準蛋白質溶液:
器材
操作方法
標準曲線測定
取16支大試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其餘試管分成兩組，分別加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升標準蛋白質溶液（濃度為250mg/ml）。用水補足到1.0毫升，然後每支試管加入5毫升試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，於室溫（20～25℃）放置10分鐘。再逐管加入0.5毫升試劑乙（Folin—酚試劑），同樣立即混勻。這一步混合速度要快，否則會使顯色程度減弱。然後在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照，於700nm處測定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質的量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪製出標準曲線。
注意：因Lowry反應的顯色隨時間不斷加深，因此各項操作必須精確控制時間，即第1支試管加入5毫升試劑甲後，開始計時，1分鐘後，第2支試管加入5毫升試劑甲，2分鐘後加第3支試管，余此類推。全部試管加完試劑甲後若已超過10分鐘，則第1支試管可立即加入0.5毫升試劑乙，1分鐘後第2支試管加入0.5毫升試劑乙，2分鐘後加第3支試管，余此類推。待最後一支試管加完試劑後，再放置30分鐘，然後開始測定光吸收。每分鐘測一個樣品。
進行多試管操作時，為了防止出錯，每位學生都必須在實驗記錄本上預先畫好下面的表格。表中是每個試管要加入的量（毫升），並按由左至右，由上至下的順序，逐管加入。最下面兩排是計算出的每管中蛋白質的量（微克）和測得的吸光度值。
樣品的測定
：取1毫升樣品溶液（其中約含蛋白質20~250微克），按上述方法進行操作，取1毫升蒸餾水代替樣品作為空白對照。通常樣品的測定也可與標準曲線的測定放在一起，同時進行。即在標準曲線測定的各試管後面，再增加3個試管。如上表中的8、9、10試管。
根據所測樣品的吸光度值，在標準曲線上查出相應的蛋白質量，從而計算出樣品溶液的蛋白質濃度。
Folin-酚法測定蛋白質含量原理
