衍生化方法

衍生化是一種利用化學變換把化合物轉化成類似化學結構的物質。

基本介紹

• 中文名：衍生化方法
• 外文名：Derivatization methods
• 類別：方法
• 對象：衍生化
• 特點：化學結構
• 拼音：yanshenghuafangfa

簡介

衍生化是一種利用化學變換把化合物轉化成類似化學結構的物質。一般來說，一個特定功能的化合物參與衍生反應，溶解度，沸點，熔點，聚集態或化學成分會產生偏離。由此產生的新的化學性質可用於量化或分離。樣品的衍生化的作用主要是把難於分析的物質轉化為與其化學結構相似但易於分析的物質，便於量化和分離。 當檢測物質不容易被檢測時，如無紫外吸收等，可以將其進行處理，如加上生色團等，生成可被檢測的物質。在儀器分析中被廣泛套用。氣相色譜中套用化學衍生反應是為了增加樣品的揮發度或提高檢測靈敏度，而高效液相色譜的化學衍生法是指在一定條件下利用某種試劑(通稱化學衍生試劑或標記試劑)與樣品組份進行化學反應，反應的產物有利於色譜檢測或分離。一般化學衍生法主要有以下幾個目的：提高樣品檢測的靈敏度；改善樣品混合物的分離度；適合於進一步做結構鑑定，如質譜、紅外或核磁共振等。進行化學衍生反應應該滿足如下要求：對反應條件要求不苛刻，且能迅速、定量地進行；對樣品中的某個組份只生成一種衍生物，反應副產物及過量的衍生試劑不干擾被測樣品的分離和檢測；化學衍生試劑方便易得，通用性好。

我們一般是遇到-NH -OH極性基團，才進行衍生化，改善色譜行為

-NH 一般加TFA

-OH 一般加TMS

分類

分衍生化常用的反應有酯化、醯化、烷基化、矽烷化、硼烷化、環化和離子化等。雖然氣相色譜已有許多衍生化方法，但它有一個致命的缺點是不能用於熱不穩定化合物。此外，對於一些有複雜基質的實際樣品，除分離上的困難外，還容易污染進樣器和損壞柱子。

衍生化反應從是否形成共價鍵來說，可分為兩種：標記和非標記反應。標記反應是在反應過程中，被分析物與標記試劑之間生成共價鍵；所有其它類型的反應，如形成離子對、光解、氧化還原、電化學反應等都是非標記反應。另一種區分衍生化反應是從衍生反應的場所來分，有柱前衍生化(pre-columnderivatization)，柱上衍生化(on-columnderivatization)和柱後衍生化(post-columnderivatization)三種。從是否與儀器在線上的角度來分有：線上(on-line)、離線(off-1ine)和旁線(at-line)(自動化)三種。目前在HPLC中以離線的柱前衍生法(簡稱柱前衍生法)與線上的柱後衍生法(簡稱柱後衍生法)使用居多，旁線衍生化方法是發展方向。

柱前衍生法和柱後衍生法各有其優缺點。柱前衍生法的優點是：相對自由地選擇反應條件；不存在反應動力學的限制；衍生化的副產物可進行預處理以降低或消除其干擾；容易允許多步反應的進行；有較多的衍生化試劑可選擇；不需要複雜的儀器設備。缺點是：形成的副產物可能對色譜分離造成較大困難；在衍生化過程中，容易引入雜質或干擾峰，或使樣品損失。柱後衍生法的優點有：（1）形成副產物不重要，反應不需要完全，產物也不需要高的穩定性，只需要有好的重複性即可；（2）被分析物可以在其原有的形式下進行分離，容易選用已有的分析方法。缺點是：（1）對於一定的溶劑和有限的反應時間來說，目前只有有限的反應可供選擇；（2）需要額外的設備，反應器可造成峰展寬，降低解析度。

衍生化試劑

衍生化試劑很多，簡單的說：它能幫你將不能分析的樣品通過衍生化試劑反應轉化為可分析的化合物.衍生化試劑比如有：烷基化試劑、矽烷化試劑、醯化試劑類、螢光衍生化試劑、 紫外衍生化試劑、苯甲醯氯衍生化試劑、羥基衍生化試劑 、 手性衍生化試劑、氨基衍生化試劑、氣相色譜和液相色譜中常用的柱前衍生化方法、固相化學衍生化法。高效液相色譜法有甲醛與2，4－二硝基苯肼（DNPH）反應生成腙，衍生化產物醛腙用有機溶劑萃取富集後，在一定溫度下蒸發、濃縮，再以甲醇或乙腈溶解或稀釋，最後進行色譜測定。

雖然已有許多的衍生化試劑被使用，但是目前開發新的衍生化試劑仍然是一個活躍的研究領域，其主要目的是不斷提高靈敏度和選擇性以及擴大套用範圍。

衍生化試劑要求：①衍生劑必須過量且穩定；不過量反應不完全，檢測不充分。不穩定，重現性差；②衍生物、衍生產物和衍生副產物至少是好分離的。當然如果只能檢測到衍生產物最好；③衍生反快速完全。反應慢，柱前衍生還可以，但柱後不行。因為流速固定，衍生池管路長度一定，留給衍生化的時間是一定的。柱前衍生可以在系統外等衍生完畢後進樣，但也是影響效率的。

矽烷化試劑

矽烷基指三甲基矽烷Si(CH3)3或稱TMS。矽烷化作用是指將矽烷基引入到分了中，一般是取代活性氫。活性氫被矽烷基取代後降低了化合物的極性，減少了氫鍵束縛。因此所形成的矽烷化衍生物更容易揮發。同時，由於含活性氫的反應位點數目減少，化合物的穩定性也得以加強。矽烷化化合物極性減弱，被測能力增強，熱穩定性提高。

矽烷化在GC分析中用途最大。許多被認為是不揮發性的或是在200～300℃熱不穩定的羥基化合物經過矽烷化後成功的進行色譜分析。

矽烷化試劑作用同時受到溶劑系統和添加的催化劑的影響。催化劑的使用(如三甲基氯矽烷，吡啶)可加快矽烷化試劑的反應。確定好矽烷化反應的時間和溫度至關重要。必須知道衍生化的轉化速率，以實現對未知樣品的定最分析。矽烷化試劑一般都對潮氣敏感，應密封保存以防止其吸潮失效。這些矽烷化試劑適用於範圍較廣，但如果使用過最，則可能給火焰離子化檢測器造成些麻煩。

三甲基矽烷是GC分析最常用的通用矽烷化基團。引入此基團可改善色譜分離，並使得特殊檢測技術的套用成為可能。

矽烷化試劑還可以用於對玻璃器具（如GC的內襯管）和色譜的擔體進行去活化。

矽烷化試劑主要是（氯）甲基矽烷系列。見下：

雙（三甲基矽烷基）乙醯胺——（BSA）

N,O-二（三甲基矽烷）乙醯胺——（BSA）

雙（三甲基矽烷基）三氟乙醯胺——（BSTFA）

二甲基二氧矽烷——（DMDCS）

六甲基二矽胺——（HMDS）

1,1,1,3,3,3六甲基矽氮烷——（HMDS）

N-(叔丁基二甲基矽烷基)-N-甲基三氟乙醯胺——(MTBSTFA)

N-甲基三氟乙醯胺——(MTBSTFA)

三氟乙酸——（TFA）

三甲基氯矽烷——（TMCS）

三甲基矽烷咪唑——（TMSI）

二甲基二氯矽烷——（DMDCS）

N-甲基-n-(三甲基矽烷)三氟乙醯胺（MSTFA）

醯基化試劑

醯化作用作為矽烷化的代替方法，可通過羧酸或共衍生物的作用將含有活潑氫合物（如-OH、-SH、-NH）轉化為酯、硫酯或醯胺。含有鹵離了的羰基基團可增強電了捕獲檢測器酞化作用具有很多優點：

保護不穩定基團，從而增加了化合物的穩定性；

可提高如糖類，胺基酸等物質的揮發性。這些物質常帶有大量的極性官能團，加熱時易分解；

有助於混合物的分離；

使用ECD檢測，分析物檢測下限可降低很多。

常用的醯基化試劑有：乙酸酐（AA）、三氟乙酸酐（TFAA）、五氟丙酸酐（PFPA）、七氟丁酸酐（HFBA）、N-甲基雙（三氟乙酸酐）咪唑（MBTFA）、1-(三氟乙醯)咪唑（TFAI）等。

烷基化試劑

烷基化作用是將烷基官能團(脂肪族或脂肪，芳香族)添加到活性官能團(H)上。以烷基基團代替氫的重要性在於生成的衍生物與原來化合物相比極性大為下降。該試劑常用於修飾改良含有酸性氫的化合物如羧酸和苯酚。

生成的產物有醚，酯，硫醚，硫酯，正烷基胺和正烷基醯胺。弱酸性官能團(如醇)的烷基化要求有強鹼催化劑（氫氧化鈉，氫氧化鉀）。酸性稍強的OH基團如苯酚和羧酸，弱鹼催化劑(氯化氫，三氟化硼)即可。

常用的烷基化試劑有重氮甲烷、2,2二甲基丙烷（DMP）、18-冠醚-6、硼酸正丁酯（NBB）、O-鹽酸甲氧基胺、五氟苄基溴（PFBBr）、N-甲基-N-亞硝基對甲苯磺醯胺（Diazald）、N,N-二甲基甲醯胺二縮叔乙醛（DMF-DBA）、N,N-二甲基甲醯胺二縮乙醛（DMF-DEA）、N,N-二甲基甲醯胺二縮甲醛（DMF-DMA）、N,N-二甲基甲醯胺二縮丙醛（DMF-DPA）、1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍（MNNG,97%） 、三甲基苯胺——（TMAH）等。

用於改善檢測性能的衍生化試劑分類

常用紫外衍生化試劑

⑴2,4-二硝基氟苯（最大吸收波長350nm，摩爾吸收係數>104）

⑵對硝基苯甲醯氯（最大吸收波長254nm，摩爾吸收係數>104）

⑶ 對甲基苯磺醯氯（最大吸收波長224nm，摩爾吸收係數=104）

⑷異硫氰酸苯酯（最大吸收波長244nm，摩爾吸收係數=104）

⑸ 對硝基苯基溴（最大吸收波長265nm，摩爾吸收係數6200 ）

⑹ 對溴代苯甲醯甲基溴（最大吸收波長260nm，摩爾吸收係數=1.8×104）

⑺ 萘醯甲基溴（最大吸收波長248nm，摩爾吸收係數=1.8×104）

⑻N,N對硝基苄基異丙基異脲(最大吸收波長265nm，摩爾吸收係數6200）

⑼3,5二硝基苯甲醯氯（最大吸收波長248nm，摩爾吸收係數=104）

⑽對甲氧基苯甲醯氯（最大吸收波長262nm，摩爾吸收係數=1.6×104）

⑾2,4二硝基苯肼（最大吸收波長254nm，摩爾吸收係數=1.8×104）

⑿ 對硝基苯甲氧胺鹽酸鹽（最大吸收波長254nm，摩爾吸收係數=6200）

常用螢光衍生化試劑

⑴丹磺醯氯（激發波長340nm，發射波長355nm）

⑵ 丹磺醯肼（激發波長340nm，發射波長525nm）

⑶ 螢光胺 （激發波長340nm，發射波長525nm）

⑷ 鄰苯二甲醛（激發波長340nm，發射波長455nm）

⑸4-溴甲基-7-甲氧基香豆素（激發波長365nm，發射波長420nm）

⑹ 芴代甲氧基醯氯（激發波長260nm，發射波長310nm）

⑺螢光素異硫氰酸酯（激發波長350nm，發射波長383nm）

⑻4-氯-7-硝基苯一氧二氮雜茂（激發波長380nm，發射波長530nm）

衍生化

作用

在GC/MS方法分析樣品時，對羥基、胺基、羧基等官能團進行衍生化有十分重要的作用，主要表現在：

1、改善樣品的氣相色譜性質。如羥基、羧基等氣相色譜特性不好。

2、改善樣品的熱穩定性。

3、改善樣品的分子質量。分子量增大，有利於樣品與基質的分離。

4、改善樣品的質譜行為。

5、引入鹵素或吸電子基團，是樣品可用CI檢測，提高靈敏度。

6、分離手性化合物。

GC/MS方法中常用的衍生化方法

1、矽烷化(silylation)

2、醯化(acylation)

3、烷基化(alkylation)

判斷衍生化反應的指標

1、反應是否迅速、定量進行，反應重複性好壞，反應條件是否溫和，是否容易操作。

2、反應選擇性高，最好只於目標化合物反應。

3、衍生化產物只有一種，反應的副產物和過量的衍生化試劑應不干擾目標化合物的分離和檢測。

4、衍生化試劑通用性好，價廉易得。

衍生化方法套用不當的弊端

1、柱上衍生化可能損傷色譜柱。

2、某些衍生化試劑需氮氣吹乾。

3、衍生化不完全，影響靈敏度。

4、衍生化試劑不當，產物分子量過大。

總之，GC/MS檢測中選用衍生化試劑時，除了和氣相色譜法相同的準則外，還應注意衍生物的質譜特性：質量碎片特徵性強，分子量適中，適合質量型檢測器檢測，有利於與基質干擾物的分離。

矽烷化衍生化方法

是氣相色譜樣品處理中套用最多的方法，它是利用質子性化合物（如醇、酚、酸、胺、硫醇等）與矽烷化試劑反應，形成揮發性的矽烷化衍生物。

常用的矽烷化試劑

矽烷化試劑中的烷基矽烷基和反應物中的羥基或胺基上的氫發生交換，形成烷基矽烷基產物。常用的矽烷化試劑有：

1、N，O－雙三甲基矽基三氟乙醯胺（BSTFA）和N，O－雙三甲基矽基乙醯胺（BTA）：能衍生化胺基和羥基。常用於體內藥物及其代謝物的檢測。

2、N－甲基叔丁基二甲基矽基三氟乙醯胺（MTBSTFA）：常用於藥物、類固醇的檢測。由於叔丁基二甲基矽基有較大的空間效應，有些胺基較難衍生化。在質譜檢測中，該衍生物很容易失去叔丁基形成較強的(M-57)+離子，有利於作為MS-MS的母離子。

3、N－甲基三甲基矽基三氟乙醯胺（MSTFA）：最常用的矽烷化試劑之一。衍生化也是引入三甲基矽基。

矽烷化的技術要點

常用的矽烷化試劑的一般衍生化條件：

在吹乾的提取物殘渣中加入100µl的MSTFA或BSTFA，加入50 µl的吡啶或乙腈，或用事先配好的衍生化試劑中加催化劑（三甲基碘矽烷TMSI或三甲基氯矽烷TMSCI）和抗氧劑（硫代赤蘚糖醇）。衍生化小瓶加蓋後在60oC衍生化5～30min，或微波衍生化2～3min，視不同化合物而定。殘渣吹乾水分對衍生化十分關鍵。因為衍生化試劑MSTFA和BSTFA遇水立即分解。

套用實例

（1）矽烷化柱前衍生氣相色譜法測定氯黴素殘留：樣品經提取，濃縮淨化、微氮吹乾後，加入100μL矽烷化試劑，經60℃30min反應。氯黴素的沸點降至可供氣相色譜或氣質聯用儀分析用。採用DB-35MS（30m×0.25mm×0.25µm）色譜柱。

（2）氧化鉛後柱衍生—HPLC法測定孔雀石綠殘留：孔雀石綠（malachite green，MG）屬於三苯甲烷類染料。無色的母體形式（leuco malachite green，LMG）是孔雀石綠在魚體及其他生物體內的主要代謝產物和存在形式，在檢測孔雀石綠在魚體內的殘留，應同時檢測MG與LMG。採用C18柱色譜柱（250×4.6mm I.D.，5μm）和Celite 545氧化鉛後柱（純PbO2（1：1），20mm×2.1mm I.D）。結果在MG、LMG與結晶紫（GV）、母體結晶紫同時檢測時，保留時間分別為：MG 8.33min、GV 14.18min、LMG 18.19min和19.84min。使用氧化鉛後柱衍生—HPLC法測定孔雀石綠殘留，具有分離效率高、快速、重現性好、儀器設備簡單等優點，是MG、LMG檢測中最常用的方法。