基本介紹
- 中文名：PCR儀
- 要素：DNA模板 Template
- 原料：四種脫氧核苷酸
- 引物：聚合酶
基本要素,工作原理,反應步驟,實現,改進與完善,分類,獲獎詳情,
基本要素
基本的PCR須具備
1.要被複製的DNA模板 Template2.界定複製範圍兩端的引物Primers.
3.DNA聚合酶Taq. Polymearse
4.合成的原料（四種脫氧核苷酸）及水。
工作原理
利用升溫使DNA變性，在聚合酶的作用下使單鏈複製成雙鏈，進而達到基因複製的目的。
反應步驟
分別是1. Denaturation 2. Annealing of primers,3. Extension of primers。 所謂 Denaturing乃是將DNA加熱（至90~95℃）變性， 將雙股的DNA加熱後轉為單股DNA以做為複製的模板. 而Annealing 則是令 Primers於一定的溫度下（冷卻至55~60℃）附著於模板DNA兩端。 最後在DNA聚合酶e.g. Taq-polymerase 的作用下（加熱至70~75℃）進行引物的延長 Extension of primers及另一股的合成。
PCR的最早構想核酸研究已有100多年的歷史，二十世紀60年代末、70年代初人們致力於研究基因的體外分離技術，Korana於1971年最早提出核酸體外擴增的構想：“經過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，並不斷重複該過程便可克隆tRNA基因”。
實現
1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis 等發明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應。其原理類似於DNA的體內複製。
改進與完善
Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺點是：
①Klenow酶不耐高溫， 90℃會變性失活，每次循環都要重新加。
②引物鏈延伸反應在37℃下進行，容易發生模板和引物之間的鹼基錯配，其PCR產物特異性較差，合成的DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術雖較傳統的基因擴增具備許多突出的優點，但由於Klenow酶不耐熱，在DNA模板進行熱變性時，會導致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個擴增反應周期，給PCR技術操作程式添了不少困難。這使得PCR技術在一段時間內沒能引起生物醫學界的足夠重視。
1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進行PCR，其擴增的DNA片段很均一，真實性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環一次，仍需加入新酶。
1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌thermus aquaticus 中提取到一種耐熱DNA聚合酶。 此酶具有以下特點：①耐高溫，在70℃下反應2h後其殘留活性大於原來的90%，在93℃下反應2h後其殘留活性是原來的60%，在95℃下反應2h後其殘留活性是原來的40%。②在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應後再加新酶。③大大提高了擴增片段特異性和擴增效率，增加了擴增長度2.0Kb。由於提高了擴增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶IKlenow片段區別，將此酶命名為TaqDNA多聚酶Taq DNAPolymerase。此酶的發現使PCR廣泛的被套用。
分類
普通的PCR儀
把一次PCR擴增只能運行一個特定退火溫度的PCR儀，叫傳統的PCR儀，也叫普通PCR儀。如果要做不同的退火溫度需要多次運行。主要是做簡單的，對目的基因退火溫度的擴增。該儀器主要套用於科研研究，教學，醫學臨床，檢驗檢疫等機構。
梯度PCR儀
把一次性PCR擴增可以設定一系列不同的退火溫度條件（溫度梯度），通常有12種溫度梯度，這樣的儀器就叫梯度PCR儀。因為被擴增的不同DNA片段，其最適退火溫度是不同的，通過設定一系列的梯度退火溫度進行擴增，從而一次性PCR擴增，就可以篩選出表達量高的最適退火溫度，進行有效的擴增。主要用於研究未知DNA退火溫度的擴增，這樣節約成本的同時也節約了時間。主要用於科研，教學機構。梯度PCR儀，在不設定梯度的情況下也可以做普通PCR擴增。具有雙槽梯度的不多，領成具備此功能。
原位PCR儀
用於從細胞內靶DNA的定位分析的細胞內基因擴增儀，如病源基因在細胞的位置或目的基因在細胞內的作用位置等。是保持細胞或組織的完整性，使PCR反應體系滲透到組織和細胞中，在細胞的靶DNA所在的位置上進行基因擴增，不但可以檢測到靶DNA，又能標出靶序列在細胞內的位置，於分子和細胞水平上研究疾病的發病機理和臨床過程及病理的轉變有重大的實用價值。
實時螢光定量PCR儀
在普通PCR儀的基礎上增加一個螢光信號採集系統和計算機分析處理系統，就成了螢光定量PCR儀。其PCR擴增原理和普通PCR儀擴增原理相同，只是PCR擴增時加入的引物是利用同位素、螢光素等進行標記，使用引物和螢光探針同時與模板特異性結合擴增。擴增的結果通過螢光信號採集系統實時採集信號連線輸送到計算機分析處理系統得出量化的實時結果輸出。把這PCR儀叫做實時螢光定量PCR儀(qPCR儀)。螢光定量PCR儀有單通道，雙通道，和多通道。當只用一種螢光探針標記的時候，選用單通道，有多螢光標記的時候用多通道。單通道也可以檢測多螢光的標記的目的基因表達產物，因為一次只能檢測一種目的基因的擴增量，需多次擴增才能檢測完不同的目的基因片段的量。該儀器主要用於醫學臨床檢測，生物醫藥研發，食品行業，科研院校等機構。
獲獎詳情
獲得諾貝爾獎的PCR技術
1993年，美國科學家Mulis眾望所歸地獲得了諾貝爾化學獎，他所取得的成就是發明了PCR技術。
PCR，中文譯為聚合酶鏈式反應，其實是一種DNA的快速擴增技術，其擴增效率之高就象核裂變的“鏈式反應”那樣。PCR技術通過兩個短的稱為引物的DNA小片段和一種耐熱的酶的作用，可以在3個小時內把特定的DNA量提高1000萬倍。這種技術一問世，立刻引起了分子生物學研究的一場革命，人們利用這種轟動全世界的技術很快就把微觀領域的生物學研究大大地往前推了一步。可以這么說，PCR技術使分子生物學研究一下子獲得了突破，而且隨著PCR技術的日趨完善，PCR在人類社會生活中的套用也越來越廣泛。比如說在“DNA指紋”中我們提到，科學家們只需要一根頭髮甚至一個細胞就可以完成DNA指紋的鑑定工作，這裡實際上就要採用PCR技術，因為一個細胞中的DNA含量實在太少了，人們根本不可能檢測到它的指紋；有了PCR技術就好辦了，通過PCR技術把這個細胞中的DNA片斷擴增1000萬倍，這樣DNA量就足夠作指紋鑑定了。再比如，在醫院裡檢驗血液中的某種病毒，有時病毒量極少（例如有的愛滋病病毒攜帶者），通過傳統的檢查方法費力又費時，這時PCR技術也許就可以幫上忙。可以先選定這種病毒DNA上的一段DNA，設計合適的引物DNA，然後通過PCR技術一擴增很快就可以判斷出血樣中是否擴增出了大量的DNA，如果是的話，那么就說明血樣中帶有該種病毒了。PCR方法不但有極高的靈敏度，而且可以同時一次做近百個擴增反應，省時省力效率高。
PCR技術神奇就神奇在以下幾個特點上：一是被擴增的DNA所需量極小，理論上講一個分子就可以用於擴增了；二是擴增效率高，目的基因的量成指數形式擴增，幾個小時就擴增1000萬倍以上。現在PCR技術已經被廣泛地套用於生命科學研究、食品衛生、醫療、法醫及環境監測等諸多方面，真不愧是“獲得諾貝爾獎”的好技術！
