基本介紹
- 中文名：DNA測序儀
- 全稱：abi prism 310型基因分析儀
- 屬性：高檔精密儀器
- 公司：美國pe abi公司
原理,發展歷史,試劑器材,操作步驟,計算,注意事項,
原理
abi prism 310型基因分析儀(即dna測序儀)，採用毛細管電泳技術取代傳統的聚丙烯醯胺平板電泳，套用該公司專利的四色螢光染料標記的ddntp(標記終止物法)，因此通過單引物pcr測序反應，生成的pcr產物則是相差1個鹼基的3''''末端為4種不同螢光染料的單鏈dna混合物，使得四種螢光染料的測序 pcr產物可在一根毛細管內電泳，從而避免了泳道間遷移率差異的影響，大大提高了測序的精確度。由於分子大小不同，在毛細管電泳中的遷移率也不同，當其通過毛細管讀數視窗段時，雷射檢測器視窗中的ccd(charge-coupled device)攝影機檢測器就可對螢光分子逐個進行檢測，激發的螢光經光柵分光，以區分代表不同鹼基信息的不同顏色的螢光，並在ccd攝影機上同步成像，分析軟體可自動將不同螢光轉變為dna序列，從而達到dna測序的目的。分析結果能以凝膠電泳圖譜、螢光吸收峰圖或鹼基排列順序等多種形式輸出。
它是一台能自動灌膠、自動進樣、自動數據收集分析等全自動電腦控制的測定dna片段的鹼基順序或大小和定量的高檔精密儀器。pe公司還提供凝膠高分子聚合物，包括dna測序膠(pop 6)和genescan膠(pop 4)。這些凝膠顆粒孔徑均一，避免了配膠條件不一致對測序精度的影響。它主要由毛細管電泳裝置、macintosh電腦、彩色印表機和電泳等附屬檔案組成。電腦中則包括資料收集，分析和儀器運行等軟體。它使用最新的ccd攝影機檢測器，使dna測序縮短至2.5h，pcr片段大小分析和定量分析為 10～40min。
由於該儀器具有dna測序，pcr片段大小分析和定量分析等功能，因此可進行dna測序、雜合子分析、單鏈構象多態性分析(sscp)、微衛星序列分析、長片段pcr、rt-pcr(定量pcr)等分析，臨床上可除進行常規dna測序外，還可進行單核苷酸多態性(snp)分析、基因突變檢測、hla配型、法醫學上的親子和個體鑑定、微生物與病毒的分型與鑑定等。
發展歷史
70年代末，WalterGilbert發明化學法、FrederickSanger發明雙脫氧終止法手動測序，同位素標記
80年代中期，出現自動測序儀（套用雙脫氧終止法原理）、螢光代替同位素，計算機圖象識別
90年代中期，測序儀重大改進、集束化的毛細管電泳代替凝膠電泳
2001年完成人類基因組框架圖
試劑器材
2．pgem-3zf (+) 雙鏈dna對照模板 0.2g/l，試劑盒配套試劑。
3．m13(-21)引物 tgtaaaacgacggccagt，3.2μmol/l，即3.2pmol/μl，試劑盒配套試劑。
7．0.2ml或和0.5ml的pcr管 蓋體分離，pe公司產品。
8．3mol/l 醋酸鈉(ph5.2) 稱取40.8g naac·3h2o溶於70ml蒸餾水中，冰醋酸調ph至5.2，定容至100ml，高壓滅菌後分裝。
9．70%乙醇和無水乙醇。
10．naac/乙醇混合液 取37.5ml無水乙醇和2.5ml 3mol/l naac混勻，室溫可保存1年。
11．pop 6測序膠 abi產品。
12．模板抑制試劑(tsr) abi產品。
13．10×電泳緩衝液 abi產品。
14．abi prism 310型全自動dna測序儀。
15．2400型或9600型pcr儀。
16．台式冷凍高速離心機。
17．台式高速離心機或袖珍離心機。
操作步驟
pcr測序反應
(1) 取0.2ml的pcr管，用記號筆編號，將管插在顆粒冰中，按下表加試劑：
所加試劑 測定模板管 標準對照管
bigdye mix 1μl 1μl
待測的質粒dna 1μl －
pgem-3zf (+) 雙鏈dna － 1μl
待測dna的正向引物 1μl －
m13(-21)引物 － 1μl
滅菌去離子水 2μl 2μl
(2) 將pcr管置於9600或2400型pcr儀上進行擴增。98℃變性2min後進行pcr循環，pcr循環參數為96℃ 10s，50℃ 5s，60℃4min，25個循環，擴增結束後設定4℃保溫。
醋酸鈉/乙醇法純化pcr產物
(1) 將混合物離心，將擴增產物轉移到1.5ml ep管中。
(2) 加入25μl醋酸鈉/乙醇混合液，充分振盪，置冰上10min以沉澱dna。12 000r/min於4℃離心30 min，小心棄上清。
(3) 加70%(v/v)的乙醇50μl洗滌沉澱2次。12 000r/min於4℃離心5min，小心棄上清和管壁的液珠，真空乾燥沉澱10～15min。
電泳前測序pcr產物的處理
(1) 加入12μl的tsr於離心管中，劇烈振盪，讓其充分溶解dna沉澱，稍離心。
(2) 將溶液轉移至蓋體分離的0.2ml pcr管中，稍離心。
(3) 在pcr儀上進行熱變性(95℃ 2min)，冰中驟冷，待上機。
分析或列印出彩色測序圖譜
上機操作按儀器操作說明書安裝毛細管，進行毛細管位置的校正，人工手動灌膠和建立運行的測序順序檔案。儀器將自動灌膠至毛細管，1.2kv預電泳5min，按編程次序自動進樣，再預電泳(1.2kv，20min)，在7.5kv下電泳2h。電泳結束後儀器會自動清洗，灌膠，進下一樣品，預電泳和電泳。每一個樣品電泳總時間為2.5h。電泳結束後儀器會自動分析或列印出彩色測序圖譜。
序列分析
儀器將自動進行序列分析，並可根據用戶要求進行序列比較。如測序序列已知，可通過序列比較以星號標出差異鹼基處，提高工作效率。
處理儀器
測序完畢按儀器操作規程進行儀器清洗與保養。
計算
測序反應精確度計算公式：100%－差異鹼基數(不包括n數)/650×100%
注意事項
1．abi prism 310基因分析儀是高檔精密儀器，需專人操作、管理和維護。
2．本實驗測序pcr反應的總體積是5μl，而且未加礦物油覆蓋，所以pcr管蓋的密封性很重要，除加完試劑後蓋緊pcr管蓋外，最好選用pe公司的pcr管。如pcr結束後pcr液小於4～4.5μl，則此pcr反應可能失敗，不必進行純化和上樣。
