實時螢光定量PCR技術於1996年由美國Applied Biosystems公司推出，由於該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點
基本內容,原理,意義,影響,優勢,
基本內容
實時螢光定量PCR 實時螢光定量PCR技術於1996年由美國AppliedBiosystems公司推出，由於該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛套用。本文試就其定量原理、方法及參照問題作一介紹。
原理
所謂實時螢光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入螢光基團，利用螢光信號積累實時監測整個PCR進程，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
在螢光定量PCR技術中，有一個很重要的概念--Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個反應管內的螢光信號到達設定的域值時所經歷的循環數（如圖1所示）。
PCR反應的前15個循環的螢光信號作為螢光本底信號，螢光域值的預設設定是3-15個循環的螢光信號的標準偏差的10倍，即：threshold=10′SDcycle6-15
研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存線上性關係〔1〕，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代Ct值（如圖2所示）。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。
螢光定量PCR所使用的螢光化學可分為兩種：螢光探針和螢光染料。現將其原理簡述如下：
1）TaqMan螢光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的螢光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告螢光基團和一個淬滅螢光基團。探針完整時，報告基團發射的螢光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告螢光基團和淬滅螢光基團分離，從而螢光監測系統可接收到螢光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個螢光分子形成，實現了螢光信號的累積與PCR產物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的首選技術平台。
2）SYBR螢光染料：在PCR反應體系中，加入過量SYBR螢光染料，SYBR螢光染料特異性地摻入DNA雙鏈後，發射螢光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何螢光信號，從而保證螢光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。
在螢光定量PCR技術中，有一個很重要的概念--Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個反應管內的螢光信號到達設定的域值時所經歷的循環數（如圖1所示）。
PCR反應的前15個循環的螢光信號作為螢光本底信號，螢光域值的預設設定是3-15個循環的螢光信號的標準偏差的10倍，即：threshold=10′SDcycle6-15
研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存線上性關係〔1〕，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代Ct值（如圖2所示）。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。
螢光定量PCR所使用的螢光化學可分為兩種：螢光探針和螢光染料。現將其原理簡述如下：
1）TaqMan螢光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的螢光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告螢光基團和一個淬滅螢光基團。探針完整時，報告基團發射的螢光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告螢光基團和淬滅螢光基團分離，從而螢光監測系統可接收到螢光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個螢光分子形成，實現了螢光信號的累積與PCR產物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的首選技術平台。
2）SYBR螢光染料：在PCR反應體系中，加入過量SYBR螢光染料，SYBR螢光染料特異性地摻入DNA雙鏈後，發射螢光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何螢光信號，從而保證螢光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。
意義
1．幾種傳統定量PCR方法簡介：
1）內參照法：在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物，內標用基因工程方法合成。上游引物用螢光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內標也被擴增。在PCR產物中，由於內標與靶模板的長度不同，二者的擴增產物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其螢光強度，以內標為對照定量待檢測模板。
2）競爭法：選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為螢光標記）。擴增後用內切酶消化PCR產物，競爭性模板的產物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產物分開，分別測定螢光強度，根據已知模板推測未知模板的起始拷貝數。
3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產物被固相板上特異的探針所結合，再加入抗地高辛或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結合物，最終酶使底物顯色。常規的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內標，作出標準曲線，也可實現定量檢測目的。
2．內標在傳統定量中的作用由於傳統定量方法都是終點檢測，即PCR到達平台期後進行檢測，而PCR經過對數期擴增到達平台期時，檢測重現性極差。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重複實驗，所得結果有很大差異（見圖4），因此無法直接從終點產物量推算出起始模板量。加入內標後，可部分消除終產物定量所造成的不準確性。但即使如此，傳統的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
1）內參照法：在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物，內標用基因工程方法合成。上游引物用螢光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內標也被擴增。在PCR產物中，由於內標與靶模板的長度不同，二者的擴增產物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其螢光強度，以內標為對照定量待檢測模板。
2）競爭法：選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為螢光標記）。擴增後用內切酶消化PCR產物，競爭性模板的產物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產物分開，分別測定螢光強度，根據已知模板推測未知模板的起始拷貝數。
3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產物被固相板上特異的探針所結合，再加入抗地高辛或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結合物，最終酶使底物顯色。常規的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內標，作出標準曲線，也可實現定量檢測目的。
2．內標在傳統定量中的作用由於傳統定量方法都是終點檢測，即PCR到達平台期後進行檢測，而PCR經過對數期擴增到達平台期時，檢測重現性極差。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重複實驗，所得結果有很大差異（見圖4），因此無法直接從終點產物量推算出起始模板量。加入內標後，可部分消除終產物定量所造成的不準確性。但即使如此，傳統的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
影響
1．實時螢光定量PCR無需內標實時螢光定量PCR技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限，實現了每一輪循環均檢測一次螢光信號的強度，並記錄在電腦軟體之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據標準曲線獲得定量結果。因此，實時螢光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的：
1）Ct值的重現性PCR循環在到達Ct值所在的循環數時，剛剛進入真正的指數擴增期（對數期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的Ct值是恆定的。
2）Ct值與起始模板的線性關係由於Ct值與起始模板的對數存線上性關係，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時螢光定量PCR是一種採用外標準曲線定量的方法。
2．內標對實時螢光定量PCR的影響
若在待測樣品中加入已知起始拷貝數的內標，則PCR反應變為雙重PCR，雙重PCR反應中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數相差比較大時，這種競爭會表現得更為顯著。但由於待測樣品的起始拷貝數是未知的，所以無法加入合適數量的已知模板作為內標。也正是這個原因，傳統定量方法雖然加入內標，但仍然只是一種半定量的方法。
美國Texas大學的科研人員進行了外標法定量和內標法定量的方法學比較，得出的結論是：內標法作為定量或半定量的手段是不可靠的，而外標準曲線的定量方法是一種準確的、值得信賴的科學方。
AppliedBiosystems公司的7700型實時螢光定量pcr儀是全球公認的螢光定量PCR的金標準，可實現多色螢光同時檢測，但定量檢測仍然採用外標準曲線的方法，而不用內標進行定量。
綜上所述，利用外標準曲線的實時螢光定量PCR是迄今為止定量最準確，重現性最好的定量方法，已得到全世界的公認，廣泛用於基因表達研究、轉基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域。
螢光PCR是分子診斷的熱點技術，它將先進的定量PCR與實時PCR技術相結合，西安天隆生產的國產實時螢光定量PCR儀為肝炎愛滋病等重大疾病的定量核酸檢測及分子診斷、同時也為沙門氏菌阪崎氏腸桿菌等食品安全檢測提供了先進手段。即使在已開發國家，螢光定量PCR儀和基因擴增儀都被廣泛用於臨床及生物學、醫學研究。由於其極高的靈敏度、極寬的檢測範圍，以及精確定量、方便快速、無視窗期等優點，美國FDA及我國國家標準已將定量PCR儀規定為確診禽流感等傳染病以及奶粉等食品安全檢測的必備儀器。
實時螢光定量PCR儀（real-timeQPCR）的發明實現了榮獲諾貝爾化學獎的PCR核酸檢測、分子診斷的技術飛躍。
1）Ct值的重現性PCR循環在到達Ct值所在的循環數時，剛剛進入真正的指數擴增期（對數期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的Ct值是恆定的。
2）Ct值與起始模板的線性關係由於Ct值與起始模板的對數存線上性關係，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時螢光定量PCR是一種採用外標準曲線定量的方法。
2．內標對實時螢光定量PCR的影響
若在待測樣品中加入已知起始拷貝數的內標，則PCR反應變為雙重PCR，雙重PCR反應中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數相差比較大時，這種競爭會表現得更為顯著。但由於待測樣品的起始拷貝數是未知的，所以無法加入合適數量的已知模板作為內標。也正是這個原因，傳統定量方法雖然加入內標，但仍然只是一種半定量的方法。
美國Texas大學的科研人員進行了外標法定量和內標法定量的方法學比較，得出的結論是：內標法作為定量或半定量的手段是不可靠的，而外標準曲線的定量方法是一種準確的、值得信賴的科學方。
AppliedBiosystems公司的7700型實時螢光定量pcr儀是全球公認的螢光定量PCR的金標準，可實現多色螢光同時檢測，但定量檢測仍然採用外標準曲線的方法，而不用內標進行定量。
綜上所述，利用外標準曲線的實時螢光定量PCR是迄今為止定量最準確，重現性最好的定量方法，已得到全世界的公認，廣泛用於基因表達研究、轉基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域。
螢光PCR是分子診斷的熱點技術，它將先進的定量PCR與實時PCR技術相結合，西安天隆生產的國產實時螢光定量PCR儀為肝炎愛滋病等重大疾病的定量核酸檢測及分子診斷、同時也為沙門氏菌阪崎氏腸桿菌等食品安全檢測提供了先進手段。即使在已開發國家，螢光定量PCR儀和基因擴增儀都被廣泛用於臨床及生物學、醫學研究。由於其極高的靈敏度、極寬的檢測範圍，以及精確定量、方便快速、無視窗期等優點，美國FDA及我國國家標準已將定量PCR儀規定為確診禽流感等傳染病以及奶粉等食品安全檢測的必備儀器。
實時螢光定量PCR儀（real-timeQPCR）的發明實現了榮獲諾貝爾化學獎的PCR核酸檢測、分子診斷的技術飛躍。
優勢
樣品到達域值水平所經歷的循環數稱為Ct值（限制點的循環數）。域值應設定在使指數期的擴增效率為最大，這樣可以獲得最準確，可重複性的數據。如果同時擴增的還有標有相應濃度的標準品，線性回歸分析將產生一條標準曲線，可以用來計算未知樣品的濃度。
⑴病原體檢測
目前，採用螢光定量PCR檢測技術可以對淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、結核分枝桿菌、EB病毒和巨細胞病毒等病原體進行定量測定。與傳統的檢測方法相比具有靈敏度高、取樣少、快速簡便等優點。如：結核菌基因診斷的意義主要表現在：
1.區分TB與其它分枝桿菌；
3.檢測TB耐藥基因；
2.提高TB的陽性檢出率。
⑵產前診斷
到目前為止，人們對遺傳性物質改變引起的遺傳性疾病還無法治療，只能通過產前監測，減少病嬰出生，以防止各類遺傳性疾病的發生，如為減少X連鎖遺傳病患兒的出生，從孕婦的外周血中分離胎兒DNA，用實時螢光定量PCR檢測其Y性別決定區基因是一種無創傷性的方法，易為孕婦所接受。
⑶藥物療效考核
對B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)定量分析顯示：病毒量與某些藥物的療效關係。HCV高水平表達，干擾素治療作用不敏感，而HCV低滴度，干擾素作用敏感；在拉米夫定治療過程中，HBV-DNA的血清含量曾有下降，隨後若再度上升或超出以前水平，則提示病毒發生變異。如PCR技術在HBV檢測中的套用及意義：
1.了解B肝病毒在體記憶體在的數量。
2.是否複製。
3.是否傳染，傳染性有多強。
4.是否有必要服藥。
5.肝功能異常改變是否由病毒引起。
6.判斷病人是適合用哪類抗病毒藥物。
7.判斷藥物治療的療效。
⑷腫瘤基因檢測
儘管腫瘤發病的機理尚未清楚，但相關基因發生突變是致癌性轉變的根本原因已被廣泛接受。癌基因的表達增加和突變，在許多腫瘤早期就可以出現。實時螢光定量PCR不但能有效地檢測到基因的突變，而且可以準確檢測癌基因的表達量。目前用此方法進行過端粒酶hTERT基因、慢性粒細胞性白血病WT1基因、腫瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關的病毒基因等多種基因的表達檢測。隨著與腫瘤相關的新基因的不斷發現，螢光定量PCR技術將會在腫瘤的研究中發揮更大的作用。
⑴病原體檢測
目前，採用螢光定量PCR檢測技術可以對淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、結核分枝桿菌、EB病毒和巨細胞病毒等病原體進行定量測定。與傳統的檢測方法相比具有靈敏度高、取樣少、快速簡便等優點。如：結核菌基因診斷的意義主要表現在：
1.區分TB與其它分枝桿菌；
3.檢測TB耐藥基因；
2.提高TB的陽性檢出率。
⑵產前診斷
到目前為止，人們對遺傳性物質改變引起的遺傳性疾病還無法治療，只能通過產前監測，減少病嬰出生，以防止各類遺傳性疾病的發生，如為減少X連鎖遺傳病患兒的出生，從孕婦的外周血中分離胎兒DNA，用實時螢光定量PCR檢測其Y性別決定區基因是一種無創傷性的方法，易為孕婦所接受。
⑶藥物療效考核
對B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)定量分析顯示：病毒量與某些藥物的療效關係。HCV高水平表達，干擾素治療作用不敏感，而HCV低滴度，干擾素作用敏感；在拉米夫定治療過程中，HBV-DNA的血清含量曾有下降，隨後若再度上升或超出以前水平，則提示病毒發生變異。如PCR技術在HBV檢測中的套用及意義：
1.了解B肝病毒在體記憶體在的數量。
2.是否複製。
3.是否傳染，傳染性有多強。
4.是否有必要服藥。
5.肝功能異常改變是否由病毒引起。
6.判斷病人是適合用哪類抗病毒藥物。
7.判斷藥物治療的療效。
⑷腫瘤基因檢測
儘管腫瘤發病的機理尚未清楚，但相關基因發生突變是致癌性轉變的根本原因已被廣泛接受。癌基因的表達增加和突變，在許多腫瘤早期就可以出現。實時螢光定量PCR不但能有效地檢測到基因的突變，而且可以準確檢測癌基因的表達量。目前用此方法進行過端粒酶hTERT基因、慢性粒細胞性白血病WT1基因、腫瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關的病毒基因等多種基因的表達檢測。隨著與腫瘤相關的新基因的不斷發現，螢光定量PCR技術將會在腫瘤的研究中發揮更大的作用。
