目的基因

把需要研究的基因稱為目的基因。（一般把需要分析的基因稱靶基因，在基因克隆過程中有時兩者均稱為插入基因，有時三者含義相近。所以有時有些書本上也籠統的稱“用限制性核酸內切酶切割目的基因（靶基因）”）

基本介紹

• 中文名：目的基因
• 外文名：Objective gene
• 拼音：mu di ji yin
• 釋義：需要研究的基因稱為目的基因
• 籠統稱呼：限制性核酸內切酶切割目的基因
• 簡稱：靶基因

目的基因製備

從細胞核中直接分離

簡單的原核生物目的基因可從擬核中直接分離得到，但人類的基因分布在23對染色體上，較難從直接法中得到。

直接分離基因最常用的方法是“鳥槍法”，又叫“散彈射擊法”。這種方法有如用獵槍發射的散彈打鳥，無論哪一顆彈粒擊中目標，都能把鳥打下來。鳥槍法的具體做法是：用限制酶（即限制性內切酶）將供體細胞中的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運載體，然後通過運載體分別轉入不同的受體細胞，讓供體細胞所提供的DNA（外源DNA）的所有片段分別在受體細胞中大量複製（在遺傳學中叫做擴增），從中找出含有目的基因的細胞，再用一定的方法把帶有目的基因的DNA片段分離出來。如許多抗蟲，抗病毒的基因都可以用上述方法獲得。

用“鳥槍法”獲取目的基因的優點是操作簡便，缺點是工作量大，具有一定的盲目性。

染色體DNA的限制性內切酶酶解

II型限制性內切酶可專一性地識別並切割特定的DNA順序，產生不同類型的DNA末端。若載體DNA與插入的DNA片段用同一種內切酶消化，或靶DNA與載體DNA末端具有互補的粘性末端，可以直接進行連線。

DNA分子經限制酶切割產生的DNA片段末端通常有兩種形式——黏性末端和平末端。當限制酶在識別序列的中心軸線兩側將DNA的兩條鏈分別切開時，產生的是黏性末端，而當限制酶在它識別序列的中心軸線處切開時，產生的則是平末端。

人工體外合成

簡短的目的基因可在了解DNA一級結構或多肽鏈一級結構胺基酸編碼的核苷酸序列的基礎上人工合成。

用逆轉錄酶製備cDNA

大多數的目的基因是由mRNA合成cDNA（反轉錄DNA）得到。從RNA入手，先從細胞提取總RNA，然後根據大多數真核mRNA含有多聚腺嘌呤（polyadenylic acid ,polyA）尾的特點，用寡聚dT纖維素柱將mRNA分離出，以mRNA為模板，在多聚A尾上結合12－18個dT的寡聚dT片段，作為合適的起始引物，在逆轉錄酶作用下合成第一條。

從基因文庫中獲取

依據：基因的核苷酸序列，功能，在染色體中的位置，轉錄產物mRNA，翻譯產物蛋白質的性質。

PCR技術擴增

PCR是多聚酶鏈式反應的縮寫，由穆里斯等人於1988年發明的，1993年獲諾貝爾獎。PCR是一種在生物體外迅速擴增DNA片斷的技術，它能以極少量的DNA為模板，在幾小時內複製出上百萬份DNA拷貝。這項技術解決了因為樣品中DNA含量太低而難以對樣品進行分析研究的問題，被廣泛地套用於遺傳疾病的疹斷、刑偵破案、古生物學、基因克隆和DNA序列測定等方面。PCR的原理是DNA雙鏈複製的原理，將基因的核苷酸不斷地加以複製，使其數量呈指數增長。利用PCR技術獲取目的基因的前提，是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據這一序列合成引物（2種）。擴增的過程是：目的基因DNA受熱變性後解旋為單鏈，引物與單鏈相應互補序列結合，然後在DNA聚合酶的作用下進行延伸，如此重複循環多次。

基因製備流程

cDNA鏈，用鹼或RNA酶水解除去mRNA，再用DNA聚合酶，最好是Klenow片段合成第二條DNA鏈。雙鏈合成後，用S1核酸酶切去髮夾結構，即可獲得雙鏈cDNA。cDNA用於探針製備、序列分析、基因表達等研究。因此以cDNA為研究材料，反映了mRNA的轉錄及對以後翻譯的影響情況，即反映某一基因（DNA）外顯子的情況。