發酵劑菌種

發酵劑是指用於優酪乳、酸牛乳酒、奶油、乾酪、納豆和其他發酵產品生產的細菌以及其他微生物的培養物。根據所發酵物質的原材料選擇適宜的發酵菌種對於發酵過程至關重要，在發酵過程中所需要的目的菌種，即為發酵劑菌種。

基本介紹

• 中文名：發酵劑菌種
• 外文名：Starter bacteria
• 類型：微生物
• 目的：發酵
• 基本分類：細菌，酵母菌，黴菌等
• 菌種選擇：產酸，產香，蛋白質水解性等

發酵劑菌種分類

在乾酪和其他發酵乳製品的加工中，採用的發酵劑菌種主要包括細菌、酵母菌、黴菌以及它們的組合形式。下面對參與乳製品發酵的相關微生物菌種的特點做一介紹。

一、鏈球菌屬

鏈球菌屬中惟一套用於乳品發酵的菌種是嗜熱鏈球菌。與其他鏈球菌不同，嗜熱鏈球菌有較高的抗熱性，能在52℃下生長，能僅僅發酵有限種類的碳水化合物進行同型乳酸發酵。多數需要在高溫下(>40℃)發酵的乳製品其酸化過程均來源於嗜熱鏈球菌和乳桿菌的聯合生長作用。通常，儘管嗜熱鏈球菌擁有不同類型的蛋白水解酶，但其水解蛋白的能力較弱。

二、乳球菌屬

乳球菌以前屬於N組鏈球菌，是主要的用於乳品發酵中進行酸化的嗜溫型微生物。乳球菌細胞呈球形或卵圓形，單生、成對或成鏈狀。革蘭氏染色陽性，兼性厭氧，不運動。所有的乳球菌通常能在4%的NaCl溶液中生長。同型乳酸發酵，當接種到乳中後，約95%的最終產物是L型乳酸。乳球菌可以在10℃生長，但不能在45℃的條件下生長。它們的水解蛋白活力較弱，可以利用乳蛋白。藉助細胞外蛋白酶的作用，乳球菌能水解牛乳中的酪蛋白。儘管乳球菌屬有5個種，但乳酸乳球菌種在乳品發酵中意義最重要。乳酸乳球菌有2個亞種：一個是乳酸乳球菌乳酸亞種；另一個是乳酸乳球菌乳脂亞種。與乳酸乳球菌乳脂亞種相比，乳酸乳球菌乳酸亞種有更高的耐鹽性和耐熱性。乳酸乳球菌乳酸亞種的一個變種是丁二酮乳酸球菌。丁二酮乳酸球菌能利用檸檬酸代謝生成丁二酮、C0₂和其他物質，賦予發酵乳品特殊的風味。部分乳酸球菌菌株也產生胞外多糖，常常被用來生產具有極為黏稠特性的斯堪地那維亞發酵乳製品，如維力、Taettamilk和Langmjolk等。

三、明串珠菌屬

與其他的乳酸菌相比，明串珠菌是獨特的，屬於乳酸異型發酵的嗜溫型球菌。明串珠菌細胞呈球形，尤其是生長在瓊脂培養基上時，通常呈豆狀。細胞成對或鏈型排列，革蘭氏陽性，不運動，不形成芽孢，兼性厭氧。明串珠菌不能水解精氨酸，需要不同的B族維生素才能生長。套用於乳品生產的明串珠菌能利用檸檬酸代謝生成丁二酮、CO₂、3一羥基丁酮等。某些菌株也能夠利用蔗糖產生葡聚糖。僅有2個明串珠菌種可以作為乳品發酵劑，一個是腸膜明串珠菌乳脂亞種，另一個是乳酸明串珠菌。因明串珠菌缺乏足夠的水解蛋白能力，通常它在乳中的生長能力非常差。儘管腸膜明串珠菌乳脂亞種在乳中無法產生足夠的乳酸而使乳凝固，但乳酸明串珠菌卻可以使乳凝固。作為發酵劑，明串珠菌常常是與乳酸球菌搭配。除使乳酸化外，二者的搭配可以產生足夠量的丁二酮和C0₂，賦予發酵乳品特殊的香味。

四、乳桿菌屬

乳桿菌是一類由遺傳和生理特性多樣的桿狀乳酸菌構成的菌屬。基於發酵的最終產物，這個屬的種可以被劃分到3組，即同型乳酸發酵的乳桿菌、兼性異型乳酸發酵的乳桿菌和專性異型乳酸發酵的乳桿菌。同型乳酸發酵的乳桿菌通過糖酵解途徑可以完全發酵己糖到乳酸，它們不能發酵戊糖和葡萄糖酸。常見於乳品發酵劑中的這類乳桿菌有：德氏乳桿菌保加利亞亞種、德氏乳桿菌乳酸亞種和瑞士乳桿菌等。與其他兩組的乳桿菌相比，它們能在高溫(>45℃)條件下生長，屬於嗜熱型的微生物。這一組的另一個種是嗜酸乳桿菌。兼性的異型乳酸發酵的乳桿菌要么僅僅發酵己糖到乳酸，要么當介質中葡萄糖含量有限時，發酵己糖到乳酸、乙酸、乙醇和甲酸等物質。藉助磷酸轉酮酶途徑，這類乳桿菌可以發酵戊糖到乳酸和乙酸。乾酪乳桿菌屬於這一組的微生物，雖然它們不常常被用在乳品發酵劑中，但在乾酪的熟化中卻能產生所希望的次生髮酵作用。

藉助磷酸轉酮酶途徑，專性異型乳酸發酵的乳桿菌能夠發酵己糖到乳酸、乙酸(或乙醇)和CO₂。戊糖也可以藉助這條途徑被代謝。這類乳桿菌在乾酪的熟化中產氣並常常產生不愉快的風味，它們產生蛋白酶、內肽酶、氨肽酶、二肽酶、三肽酶和專一性脯氨酸肽酶等。一個典型的專性異型乳酸發酵的乳桿菌是開菲爾乳桿菌，常常是與生產開菲爾發酵劑有關的種。

乳酸菌中，乳桿菌對酸的忍耐性最強，適宜於在酸性條件(pH5.5—6.2)下啟動生長，且常常降低乳的pH到4.0以下。當以純培養物接種到乳中時，乳桿菌在乳中生長緩慢。有鑒於此，為了快速啟動乳的發酵過程，乳桿菌通常是與嗜熱鏈球菌聯合使用。

五、丙酸細菌

丙酸細菌是一類非芽孢的，形態多樣的革蘭氏陽性桿菌，能夠利用蔗糖和乳酸形成丙酸、乙酸和C0₂，屬於厭氧到微好氧的嗜溫菌。丙酸細菌並不屬於乳酸菌，而是與放線菌組中的棒桿菌非常相似。儘管乾酪中可以分離到4種丙酸細菌，但薛氏丙酸細菌是最重要的用於乾酪生產的菌種。由於原料乳中存在的丙酸細菌其數量不能滿足發酵的要求，因此，它通常需要與乳酸菌一起使用以形成乾酪的網眼結構。

丙酸菌能夠利用有機和無機氮源，但對胺基酸的要求是不同的。大多數菌株的生長需要生物素。生產乾酪的發酵劑可以在包括蛋白水解物、酵母膏和以乳酸作為碳源的複合培養基中生長。

丙酸菌可以利用乾酪發酵中產生的乳酸來生長。乳酸先被氧化成丙酮酸，然後丙酮酸要么被轉變成乙酸和C0₂，要么被轉化為丙酸。C0₂可以使瑞士乾酪和類似品種的乾酪產生網眼結構，而包括胺基酸、脂肪酸的其他代謝產物對這些乾酪的風味有重要影響。

六、短桿菌

短桿菌是一類需氧的、形態多樣的革蘭氏陽性桿菌，它可以在表面熟化乾酪品種的表面生長。從這類乾酪中分離出來的短桿菌通常是線狀短桿菌。線狀短桿菌可以產生一種橘黃色的胡蘿蔔素，從而使乾酪表面具有特定的顏色。當與光接觸時，乾酪色澤的形成會加速。儘管在較老的培養物中觀察到的短桿菌是球形的，但在對數生長期該菌可呈現細長的桿狀。線狀短桿菌不能利用乳糖或檸檬酸，但可以利用乾酪發酵產生的乳酸生長。因線狀短桿菌在中性pH條件下生長最好，所以只有當乾酪表面的乳酸被中和或被酵母菌、微球菌代謝後，它才能良好的生長。由於表面熟化乾酪屬於表面鹽化，所以像酵母菌和微球菌一樣，線狀短桿菌能在高鹽濃度下生長良好。

線狀短桿菌具有很高的蛋白水解活性，能夠降解乳清蛋白和酪蛋白。因能夠使胺基酸降解成銨以及使蛋氨酸降解為巰基甲烷，所以線狀短桿菌在表面熟化乾酪濃郁風味的形成中具有一定的作用。線狀短桿菌產生的其他揮發性物質也會影響表面熟化千酪的典型風味，這些物質是丁酸、己酸、苯甲醇等。線狀短桿菌在含有蛋白水解物、葡萄糖、酵母膏、磷酸鉀、硫酸鎂的培養基中生長良好。

七、腸球菌屬

腸球菌屬是將原先Lancerield D組的鏈球菌，即糞鏈球菌和屎鏈球菌重新定名為糞腸球菌和屎腸球菌。自1984年建立腸球菌屬以來，有9個種是來自於原先的鏈球菌屬，並新增加了10個新種。腸球菌是一類革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的微生物，能利用葡萄糖進行同型發酵，產生L型乳酸，也能從胺基酸降解中獲得能量。它們擁有磷酸烯醇丙酮酸磷酸轉移酶系統，從而能夠吸收利用乳糖和其他的碳水化合物，包括葡糖酸。

腸球菌常被用作食品安全的指示菌，它可能與通過食物傳染的疾病有關。在南歐生產的乾酪中，人們用腸球菌作為發酵劑。此外，商業上人們也利用它們作為益生茵，以便預防和治療腸道菌群失調疾病。所有腸球菌中，僅有糞腸球菌和屎腸球菌可以作為重要的益生菌。這兩種腸球菌可以藉助它們對阿拉伯糖和山梨糖醇的發酵狀況，藉助它們在生長溫度等方面的差異區分開來。

八、雙歧桿菌屬

雙歧桿菌屬於放線菌科，其代謝產物是乳酸和乙酸，兩者的比例為2：3。雙歧桿菌擁有6一磷酸果糖磷酸解酮酶，但乳酸菌不具有這種酶。正是因為雙歧桿菌DNA的G+C含量很高[約為55%～57%(摩爾分數)]以及它們在生物系統發育中的位置，人們才將其劃歸到革蘭氏陽性菌的放線菌中。然而，29個雙歧桿菌菌種在形態上表現出極大的差異，所以雙歧桿菌的分類和命名仍處在不斷的發展中，以至於現在正在使用的許多雙歧桿菌益生菌仍缺乏適宜的種名。鑒於生化反應並不能總是非常有效地對從乳品中分離出來的菌株進行分類，所以只有採取多種手段並用，即採取基因型和表型特徵的結合的辦法才能夠對不同的雙歧桿菌菌種進行分類。雙歧桿菌的自然生長環境是寄主的腸道，但在污水、陰道微生物菌群、牙齒縫等環境中也能找到它們。作為益生菌套用的最重要的雙歧桿菌是長雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌和動物雙歧。

雙歧桿菌菌株具有不同的酶促能力，所以很難採用一種培養基來對所有的菌種進行培養。從技術角度上，選擇雙歧桿菌菌株作為益生菌的標準包括：①在廉價培養基中生長，獲得高細胞濃度的能力；②菌體在濃縮中維持健壯的能力；③菌體收穫、添加保護劑冷凍或冷凍乾燥的抗性能力等。此外，菌體必須能夠在產品的整個貨架期內維持其活性和特性。從醫學角度上，選擇雙歧桿菌作為益生菌的標準包括：①對胃、小腸、膽鹽的耐受力；②生理性的生長與持續性能力；③在上皮細胞上的黏附能力；④在上皮細胞上的生長能力和持續性；⑤凝集作用的能力；⑥抗菌物質的產生和敏感性等。

可能是缺乏小肽和自由胺基酸的緣故，雙歧桿菌在乳中的生長能力非常弱。當在乳中添加酪蛋白水解物或酵母膏時，某些菌株表現出較好的生長能力。那些能在乳中生長良好的雙歧桿菌菌株或許是受到了某些自然存在的生長因素刺激，比如受到特殊的酪蛋白衍生物或者寡聚糖的刺激。

由於雙歧桿菌具有平衡人體腸道系統的作用，所以，最近人們更加有意識地將雙歧桿菌投放到乳品中。在優酪乳中，因為雙歧桿菌產酸較慢，所以雙歧桿菌通常和普通的優酪乳菌種一起使用來製作優酪乳。然而，後酸化以及德氏乳桿菌保加利亞亞種生成的拮抗物質或許對雙歧桿菌在乳品中的存活產生不利影響。儘管多數雙歧桿菌是酸敏感型的，但某些菌株仍能在pH低至4.0的條件下存活。雙歧桿菌在乳中的存活能力受到貯藏溫度、初始茵數、貯藏時間和測試菌株的影響。在於酪中，儘管存在不利的鹽濃度和貯藏溫度等因素，雙歧桿菌仍能維持較高的數量。通常，雙歧桿菌對逆境條件會表現出多樣化的反應，因此，選擇合適的菌株是非常重要的。

九、青黴菌

青黴菌屬於半知菌門絲孢菌綱的微生物。屬於這個綱的黴菌直接在菌絲或分生孢子梗上產生分生孢子。青黴菌的分生孢子梗從菌絲和接近尖端的分枝上垂直升起，形成一個像掃帚狀的末端。兩組青黴菌經常套用於乾酪生產，它們是白青黴和藍青黴。常用的白青黴菌是坎培波爾特青黴，這種青黴菌可以在坎培波爾特軟乾酪、布里乾酪或類似乾酪品種的表面生長。常用的藍青黴菌是洛克菲特青黴，這種青黴菌主要用於生產像法式洛克菲特乾酪、義大利哥根索拉乾酪和斯提爾敦乾酪等藍紋乾酪品種。藍青黴菌可以在藍紋乾酪的內部生長。坎培波爾特青黴與共同青黴菌(P．comm“以e)親緣關係較近，而共同青黴菌是乾酪生產中最常見的污染菌種，它能產生多種毒素；而坎培波爾特青黴僅產生一種真菌毒素，即環狀降片酸。洛克菲特青黴與肉色青黴菌和潘氏青黴親緣關係較近。肉色青黴菌可以產生展青黴毒素；而潘氏青黴既可以產生展青黴毒素，也可以產生真菌毒素球二孢素。

坎培波爾特青黴和洛克菲特青黴均具有分解脂肪和蛋白質的能力，兩者都能產生甲基酮和自由脂肪酸，但洛克菲特青黴能產生較高水平的甲基酮和自由脂肪酸，所以可以賦予藍紋乾酪獨特的風味和香味。坎培波爾特青黴可以產生一種極為複雜的混合物，從而影響坎培波爾特乾酪和布里乾酪的風味，這種複雜的混合物主要是由2一庚烷、2一庚酸、1一辛烯一3一辛醇、2一壬烷、酚、丁酸和甲基肉桂酸等構成。

十、酵母菌

除乳酸菌外，乳中的酵母菌可進行所謂的乳酸和乙醇的發酵。在乳品生產中，這種類型的發酵僅限於開菲爾乳和馬奶酒的生產。在開菲爾發酵劑中，即在人們通稱的開菲粒中，儘管其確切的微生物組成依舊處在爭論中，但Tamin和Robinson指出，開菲爾假絲酵母和高加索乳桿菌是開菲粒中經常能分離到的主要微生物種類。Meyer等1984年指出，開菲爾粒中占優勢的酵母菌種類是開菲爾假絲酵母菌或馬克西努克魯維氏酵母菌。顯然，對開菲爾乳而言，開菲爾假絲酵母是重要的。從生理形態上，當在25℃培養3d時，開菲爾假絲酵母能在含葡萄糖、酵母膏和蛋白腖的液體培養基中形成短到長的卵形細胞。生長在瓊脂培養基上，開菲爾假絲酵母能維持一個月的活性，菌落呈奶油般黃色狀，柔軟，具精美的網狀外觀。當生長在玉米漿培養基中，假菌絲看上去像粗糙、略為彎曲的枝條。它的DNA G+C含量是41.3%，能夠發酵葡萄糖、半乳糖和蔗糖產生乙醇；而乳糖的發酵能力是可變的，與採用的菌株有關。

菌種的選擇

菌種的選擇對發酵劑的質量起著重要作用，應根據生產目的不同選擇適當的菌種。同時對菌種發育的最適溫度、耐熱性、產酸力以及是否產生黏性物質等尤其要特別注意。一般選用兩種或兩種以上的發酵劑菌種混合使用，相互產生共生作用。目前通常選用的基本菌種是嗜熱鏈球菌和保加利亞桿菌，以及乳酸鏈球菌等。但根據目的不同可以追加不同的其他乳酸菌，如：①為了提高優酪乳的保健作用，追加嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌等功能菌，增加這些菌在腸道的定殖能力；②為了增加產品的營養和生理價值，可以添加能合成維生素的特殊菌，特別是合成B族的乳酸菌，如能合成維生素B₁₂的謝氏丙酸桿菌，能合成維生素B₁₂和維生素B₂的明串珠菌，能合成煙酸、維生素C、維生素B₁₂的嗜酸乳桿菌等；③為了改善產品的風味，可添加雙乙醯乳鏈球菌或明串珠菌，屬於產香菌；④為了改善產品的硬度，可添加能產生黏性物質的乳鏈球菌變種；⑤為增強對生長阻礙物質(特別是青黴素)的抗性，可添加乳酸片球菌。

菌種配合時一般是嗜熱鏈球菌和保加利亞桿菌按1：1比例配合，乳酸鏈球菌與保加利亞桿菌以4：1配合，常用作發酵乳的發酵劑菌種。選擇質量優良的發酵劑應從以下幾方面考慮。

產酸能力

不同的發酵劑產酸能力會有很大的不同。判斷發酵劑產酸能力的方法有兩種，即測定酸度和產酸曲線。產酸能力過強的發酵劑在發酵過程中容易導致產酸過度和後酸化過強，而產酸能力弱的發酵劑在生產中產酸過慢，發酵時間過長，容易導致雜菌污染，所以生產中一般選擇具有適度產酸能力的發酵劑。

後酸化

後酸化是指酸乳生產中終止發酵後，發酵劑菌種在冷卻和冷藏階段仍能繼續緩慢產酸，它包括三個階段：從發酵終點(42℃)冷卻到19℃或20℃時酸度的增加；從19℃或20℃冷卻至10℃或12℃時酸度的增加；在冷庫中冷藏階段酸度的增加。酸乳生產中應選擇後酸化儘可能弱的發酵劑，以便控制產品質量。

產香性

一般酸乳發酵劑產生的芳香物質為乙醛、丁二酮、丙酮和揮發性酸。評價方法有：

1)感官評價

進行感官評價時應考慮樣品的溫度、酸度和存放時間對品評的影響。品嘗時樣品溫度應為常溫，因為低溫對味覺有阻礙作用；酸度不能過高，酸度過高會將香味完全掩蓋；樣品要新鮮，用生產24～48h內的酸乳進行品評為佳，因為這段時間內是滋味、氣味和芳香味的形成階段。

2)揮發性酸的量

通過測定揮發性酸的量來判斷芳香物質的產生量。揮發性酸含量越高就意味著產生的芳香物質含量越高。

3)乙醛生成能力

乙醛是形成酸乳的典型風味的主要因素之一，不同的菌株產生乙醛的能力不同，因此，乙醛生成能力是選擇優良菌株的重要指標之一。

黏性物質的產生

發酵劑在發酵過程中產黏有助於改善酸乳的組織狀態和黏稠度，特別是酸乳乾物質含量不太高時顯得尤為重要。但一般情況下產黏發酵劑往往對酸乳的發酵風味會有不良影響，因此選擇這類菌株時最好和其他菌株混合使用。

蛋白質的水解性

乳酸菌的蛋白水解活性一般較弱，如嗜熱鏈球菌在乳中只表現很弱的蛋白水解活性，保加利亞桿菌則可表現較高的蛋白水解活性，能將蛋白質水解，產生大量的游離胺基酸和肽類。影響蛋白質水解活性的因素主要有：

1)溫度

蛋白質水解活性低溫(如℃冷藏)下低，常溫下增強。

2)pH

不同的蛋白水解酶具有不同的最適pH，pH過高易積累蛋白質水解的中間產物，給產品帶來苦味。

發酵劑菌種的分離、鑑別與活化

製造優酪乳時，如果沒有純培養的發酵劑原菌，可以向菌種保藏單位購買。這種菌一般都是純培養的粉末狀乾燥菌，密封在小玻璃瓶里，使用時可根據說明書進行擴大培養以製備發酵劑。若索取不到純培養原菌，可以從天然牛奶或優酪乳里分離，經過鑑定、篩選之後，再製成發酵劑原菌。可按照下述操作程式進行。

分離

取市售新鮮酸乳或泡製酸菜的酸液稀釋，取其中的10^-4、10^-5兩個稀釋度的稀釋液各0.1～0.2mL，分別接入BCG牛乳培養基瓊脂平板上，用無菌塗布器依次塗布；或者直接用接種環蘸取原液平板畫線分離，置40℃培養48h，如出現圓形稍扁平的黃色菌落及其周圍培養基變為黃色者初步定為乳酸菌。

鑑別

選取乳酸菌典型菌落轉至脫脂乳試管中，40℃培養8～24h。若牛乳出現凝固，無氣泡，呈酸性，塗片鏡檢細胞桿狀或鏈球狀（兩種形狀的菌種均分別選入），革蘭氏染色呈陽性，則可將其連續傳代4-6次，最終選擇出在3～6h能凝固的牛乳管，作菌種待用。可參照細菌鑑定手冊進行鑑別。

活化

保存日期過長，活力已很弱的發酵劑原菌，使用時必須進行活化，可在培養基中添加1%—3%的酵母自溶膏和0.15%的檸檬酸鈉、葡萄糖與酵母浸膏，或向每100 mL培養基中添加2.5mg脯氨酸或0.09%的谷胱甘肽增強菌的活性。VC、葉酸、VA、VB₁、尼克酸、番茄汁或肝浸出液等也有刺激和增強菌的活性的作用。活化可用脫脂乳培養基添加上述微量成分後在試管內接種原菌，於40～42℃培養4～8h，取出再接種於新的試管中培養，如此繼續進行3-4代之後，即可充分發揮其活性，最後放4℃冰櫃貯存備用。