基本介紹
- 藥品名稱：沙立度胺
- 別名：沙立度胺，反應停，酞胺哌啶酮 沙利度胺
- 用法用量：口服：每日100～200mg，分4次服
- 劑型：片劑
醫藥名詞,藥物性狀,作用機制,免疫調節作用,抗炎作用,抗血管生成作用,調節細胞黏附,藥理作用,臨床套用研究,不良反應,注意事項,用法用量,藥物製劑,抑制乳腺癌細胞增殖實驗,摘要,材料與方法,結果,討論,
醫藥名詞
藥物性狀
作用機制
免疫調節作用
Thd的免疫調節作用很大程度上依實驗條件不同而不同，結果有時相互矛盾。對淋巴細胞的作用包括降低CD4+細胞和刺激CD8+細胞，從而降低CD48比率。另外，Thd似乎誘導Th1應答向Th2應答轉變。Mchugh等[1]比較了環孢素與Thd對T淋巴細胞的兩種亞型Th1和Th2作用，發現Thd能夠誘發並增強IL-4和IL-5的合成，抑制植物凝集素刺激的人外周血單核細胞合成干擾素γ（IFN-γ），降低TNF-α、IL-6和IL-10mRNA的水平，而對IL-12和IFN-γmRNA的水平無影響。對淋巴細胞增殖的影響：Fernndez等[2]認為，Thd發揮其免疫調節能力是通過激活T淋巴細胞產生IL-2和表達高親和力的IL-2受體，促進淋巴細胞增殖來實現的。
沙利度胺片
沙利度胺片抗炎作用
Thd的抗炎作用主要基於抑制腫瘤壞死因子-α（TNF-α），TNF-α是主要的致炎細胞因子。免疫學研究證實，單核細胞產生的TNF-α參與宿主免疫正常過程，但如果過量產生TNF-α，則可刺激機體產生一系列的炎症反應，例如TNF-α是導致許多細菌感染性疾病產生的中毒性休克的關鍵因素之一。Moreir等[3]給7～9周雌鼠靜脈注射脂多糖100～350μg後，測定TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10，這些細胞因子水平明顯升高，而在注射脂多糖前，給予Thd 20mg/kg，TNF-α的合成減少93%，TNF-αmRNA的合成減少70%，IL-6水平降低50%，使用Thd後脂多糖的半數致死量也明顯提高。Thd抑制TNF-α合成的作用依細胞類型和誘導劑的不同，結果也有差異。Thd抑制TNF-α合成的機制尚未完全清楚，近年有研究表明Thd通過抑制抑制性κB（IκB）激酶來抑制NF-κB的活性[4]，從而抑制TNF-α合成。Thd的抗炎作用還包括抑制環氧化酶（COX）。Noguchi等[5]研究認為，Thd有COX-1/2的抑制活性，可與阿司匹林類藥媲美，其結構研究得出了可作為潛在的COX-1/2抑制劑、COX-1選擇性及COX-2選擇性抑制劑。
抗血管生成作用
1994年D'Amato等[6]發現口服Thd能夠顯著抑制bFGF誘導的兔角膜血管生成，推測Thd致畸作用可能因為抑制了胎兒發育過程中的肢芽血管生成所致。Belo等[7]報導，Thd對海綿誘導的小鼠纖維血管生成的抑制率達40%。Verheul等[8]以Thd與舒林酸合用對bFGF和血管內皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）誘導的兔角膜血管生成抑制率分別達65%和74%。Moreir等[9]發現Thd及其類似物CC-1609在體外可顯著抑制內皮細胞的增殖，並伴核因子SP1（transcriptionfactor1）和NF-κB（nuclearfactor-κB）的低表達，推測Thd抗血管生成作用與其抑制SPl和NF-κB有關。Price等[10]檢測到Thd的體內兩種代謝產物5-OH-thalidomide和5'-OH-thalidomide，並在鼠動脈模型上證實了後者的抗血管生成活性，而前者無此作用。但在體外實驗及人隱靜脈模型中未發現5'-OH-thalidomide有抗血管生成活性。有人認為，Thd的抗血管生成作用有種屬特異性[11]，單劑Thd對家兔有血管生成抑制作用，而對小鼠沒此作用。Belo等[7]的實驗證實了，Thd對小鼠血管生成的抑制作用，但未發現Thd對同種系小鼠所荷Ehrlich瘤有抑制作用，因而推測Thd的抗血管生成並非種屬特異性，而是組織特異性。Myoung等[12]以200mg/kg/d劑量Thd，治療口腔上皮細胞癌裸鼠，發現腫瘤組織VEGFmRNA，VEGF蛋白和CD31表達水平均明顯低於對照組，但口腔上皮細胞癌大小在實驗組與對照組間無差別。復旦大學沈梅等報導，Thd能明顯抑制人卵巢細胞癌裸鼠皮下移植瘤生長和血管生成，實驗組和對照組腫瘤體積分別為649.72士274.39和1086.15士262.25mm3（p<0.01）。
沙利度胺
沙利度胺調節細胞黏附
整合素（integrin）是由白細胞合成和分泌的一種跨膜蛋白，由a和β兩個亞基組成，能通過調節細胞與細胞外基質相互作用來調節細胞粘附，其中以整合素αvβ3最為重要。胞間黏附分子1（ICAM-1）、血管細胞黏附分子（vascularcelladhensionmolecule，VCAM-1）等都是整合素αvβ3的配體。體外實驗[13]發現Thd能明顯下調T細胞表面的黏附分子ICAM-1和LFA-1表達，抑制T淋巴細胞黏附分子（celladhensionmolecule，CEM）和臍靜脈內皮細胞間的黏附。Stephens等[14]認為，Thd正是通過整合素αvβ3（血管生成正性調控因子）來抑制血管生成的，它與αvβ3基因及其某些正調控基因啟動子序列GC盒中，富含GC區域結合而抑制αvβ3的轉錄，而不同種屬和器官組織血管調控通路對αvβ3的依賴性決定了其對thalidomide的敏感性，這就解釋了不同研究中Thd抗血管生成的效能並不一致的原因。
沙利度胺
沙利度胺藥理作用
1免疫調節作用Moreaira等在鼠靜注脂多糖30mg後，測定TNF-α、IL-1、IL-6和IL-10細胞因子，這些細胞因子的水平明顯升高，而在注射脂多糖前，給予沙利度胺20mg/kg，TNF-α的合成可以減少93%，TNF-αmRNA的合成可以減少70%，IL-6的水平降低50%，使用沙利度胺後脂多糖的半數致死量也明顯提高。沙利度胺抑制TNF-α合成的作用依細胞類型和誘導劑的不同，結果也有差異。有人用環孢素A與沙利度胺進行比較，測定兩者對T淋巴細胞的兩種亞型TH1和TH2的作用，發現沙利度胺能夠誘發並增強IL-4和IL-5的合成，抑制植物凝集素刺激人外周血單核細胞合成IFN-γ，降低TNF-α、IL-6和IL-10mRAN的水平，而對IL-12和IFN-γmRAN水平無影響。此外，沙利度胺還可以激活T淋巴細胞產生IL-2，促進T淋巴細胞增殖。
2抑制腫瘤細胞生長作用骨髓瘤患者的骨髓中，可見血管增生，產生骨髓心血管化，近幾年的研究發現，沙利度胺能夠抑制兔角膜中鹼性成纖維細胞產生因子的表達，進而減少兔角膜血管的生成，具有搞血管新生作用，因此，它有抗腫瘤和抗增殖的作用。此外，沙利度胺還可以通過其代謝產物抑制腫瘤細胞與ConA覆蓋的聚乙烯微粒的附著，且這種抑制腫瘤細胞與底物附著能力對細胞並無毒性作用。
3對大鼠急性肝功能衰竭的保護作用腫瘤壞死因子（TNF-α）是由單核巨噬細胞所分泌的一種細胞因子，肝病患者TNF-α的表達水平升高，與肝壞死的程度密切有關，劉樹人等用急性肝功能衰竭的大鼠模型，灌胃給予沙利度胺，觀察其對大鼠死亡率、細胞因子、轉氨酶、肝組織病理學和單個核細胞腫瘤壞死因子mRNA表達的影響，結果大鼠的病死率沙利度胺組（40%）明顯比模型組（72.0%）低，其中TNF-α、轉氨酶的水平也明顯低於模型組，對其他細胞因子也有抑制作用。
4對炎症的作用沙利度胺對鼠關節炎模型（類風濕性關節炎）可減輕其關節炎症狀，呈劑量依賴性，這種作用與降低TNF-α和血管內皮生長的水平有關。實驗證明沙利度胺可使急性敗血症鼠模型的TNF-α的含量降低而減輕其炎症反應並使動物的存活率由19%提高到53%。
臨床套用研究
1治療麻風性結節紅斑以色列皮膚病學沙利度胺作為鎮靜藥給麻風性結節紅斑病人使用，症狀迅速改善。以後許多例麻風性結節紅斑病人使用反應均獲得很好的治療效果，最近美國和英國批准本品用於治療嚴重性或復發性麻風性結節病的皮膚症狀。
2治療皮膚性血管紅斑狼瘡國外多位學者報導沙利度胺對傳統治療無效的狼瘡皮膚病變，可以獲得滿意的療效。另一組研究結果稱，沙利度胺用於對糖皮質激素治療無效的皮膚性紅斑狼瘡者，結果在90%（18/20）完成研究的病人中出現完全緩解，另2例出現部分緩解，沙利度胺有替代激素的作用。
骨結構
骨結構3治療重症肝炎用沙利度胺治療11例重症肝炎，並且對外周血中單個核細胞分離，體外培養，觀察沙利度胺對單個核細胞TNF-α和其他細胞因子的影響，結果表明沙利度胺可以抑制單個核細胞TNF-α和其他細胞因子的產生，這些因子共同參與肝細胞的損害，其水平與肝損害的程度密切相關。結果顯示，沙利度胺通過抑制上述有害因子的產生，而在治療重症肝炎中有積極的意義。
4治療復發性口瘡病復發性口瘡是最常見的口腔黏膜病，以往治療方法極少有滿意的根治效果，姜軍松等報導了採用雙盲法研究用反應停、己酮可可鹼治療復發性口瘡患者，結果完全緩解，對照組僅有6.0%完全緩解，各研究組的治療結果以反應停聯合己酮可可鹼組療效最佳。國外還有許多人報導用反應停治療復發性口腔、生殖器潰瘍獲得了良好效果。
不良反應
沙利度胺除了致畸作用外，在研究中觀察到的常見不良反應有：輕、中度便秘、疲勞、嗜睡、各種周圍神經病變、直立性低血壓，部分病人可發生紅疹、水腫、甲狀腺功能不足和中性白細胞減少。其中，致畸作用是其最大的危害，因此應慎重選用沙利度胺，對孕婦應禁用，對育齡孕婦最好不用，非用不可時，用藥前應檢查是否懷孕，使用中要絕對避免懷孕，對病人要做好有關沙利度胺安全性的宣傳和指導工作，做好沙利度胺的不良反應監測工作。既要絕對保證用藥安全，又要使病人消除顧慮放心地使用沙利度胺，做到安全高效使用沙利度胺。
沙立度胺
沙立度胺沙利度胺的研究展示了它美好前景，它在多種疑難重症治療中起著無與倫比的作用，相信在今後的研究，將會使它的治療效果更加確切、機制更加清楚，會給更多的無望患者帶來希望。如果通過改變其結構，克服其嚴重的致畸作用，提高其療效，它將會發揮更大的作用。隨著臨床套用的改變及其研究的進展，沙利度胺會重新得到臨床的認可。
注意事項
（2）副作用有口乾、頭昏、倦怠、噁心、腹痛、面部浮腫等。
用法用量
口服：每日100～200mg，分4次服。對嚴重反應，可增至300～400mg（反應得到控制即逐漸減量）。對長期反應，需要較長期服藥，每日或隔日服25～50mg。
藥物製劑
片劑：每片25mg。
抑制乳腺癌細胞增殖實驗
摘要
背景與目的：觀察沙立度胺對體外乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231的抑制作用，以及對細胞凋亡和細胞周期的影響。材料與方法：經不同濃度(10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)的沙立度胺處理MCF-7和MDA-MB-231細胞不同時間(24h、48h、72h)後，採用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測各組細胞存活和生長情況，分析量效關係、時效關係。採用流式細胞儀檢測沙立度胺對細胞凋亡和細胞周期的影響。結果：在10～200μg/ml濃度範圍，沙立度胺對MCF-7和MDA-MB-231細胞增殖均有抑制作用(P<0.01)。在藥物作用48h後，對各組細胞的抑制率均達到高峰，尤以100μg/ml濃度組抑制率最高。沙立度胺作用後的乳腺癌細胞在流式細胞分析圖上見細胞凋亡峰(亞G1峰)，100μg/ml沙立度胺作用48h後，MCF-7和MDA-MB-231細胞凋亡率分別為9.66%和11.18%，與對照組凋之率比較差異有統計學意義(P<0.01)。結論：沙立度胺對MCF-7和MDA-MB-231細胞的體外增殖具有明確抑制作用，並可誘導細胞凋亡。
材料與方法
1.1 細胞株與材料 人乳腺癌細胞由河北醫科大學附屬第四醫院科研中心保存。沙立度胺(thalidomide)為Sigma公司產品，批號093K461。溶於二甲基亞碸(DMSO)配製成50mg/ml濃度儲存備用。四甲基偶氮唑藍(MTT)為華美生物工程公司產品，流式細胞儀(FACS420)為美國BD公司產品。
1.2 細胞培養 將MDA-MB-231、MCF-7細胞置於含有10%胎牛血清的DMEM培養液中(pH7.2～7.4)，在37℃、5%CO2和飽和濕度條件下培養。待細胞貼壁生長鋪滿瓶壁時，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對數生長期的細胞進行實驗。
1.3MTT法檢測細胞增殖反應 將細胞懸液接種於96孔培養板，每孔100μl含1×104個細胞，置於CO2培養箱中，37℃培養24h，待細胞附壁後小心吸出各孔內培養液，設定溶劑對照組及4個含不同沙立度胺濃度(10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)的DMEM培養液組，控制溶劑終濃度<0.5%(V/V)，並將上述各組又細分為不同時間組(24h、48h、72h)以觀察時效關係。每組均設3個復孔，置於CO2培養箱中，37℃繼續培養，培養結束前4h，各培養孔加入MTT(5mg/ml)10μl，4h後，棄上清，每孔加入10%DMSO100μl，震盪10min後，用全自動酶標儀檢測各孔吸光度值(OD570)，上述實驗重複3次。用下式計算抑制率(cytotoxicindex,CI)：
沙利度胺對骨髓瘤的作用
沙利度胺對骨髓瘤的作用抑制率正值表示對細胞有殺傷作用，負值表示對細胞有促增殖作用。
1.4 流式細胞技術檢測細胞凋亡 設定溶劑對照組及實驗組(沙立度胺100μg/ml)培養48h，製成單細胞懸液，去上清並固定，調整細胞濃度為1×106/ml，取1ml細胞懸液，加入胃蛋白酶2ml，溫育消化後離心棄上清液；加入1mlEB染液一步插入法進行DNA染色，用500目銅網過濾後上機測定。採用EB染色法分別測定3組細胞中的DNA含量變化及細胞凋亡情況。在DNA含量直方圖上觀察Sub-G1峰(凋亡細胞峰)是否出現。按下式計算凋亡指數(apoptoticindex，APOI)：
APOI=(凋亡細胞數/所測細胞總數)×100%
結果
2.1 沙立度胺對MCF-7和MDA-MB-231細胞增殖的影響 結果見表1、2。沙立度胺各濃度組對MCF-7和MDA-MB-231細胞均有明顯的抑制作用，同一濃度組作用24h、48h、72h的3個時間點中，當≥100μg/ml時以48h抑制率最高。不同濃度組處理MCF-7細胞48h，以100μg/ml組抑制率最高。
討論
沙立度胺化學名稱是N-(2,6-二氧3-哌啶基)-鄰苯二甲醯亞胺或2-(2,6-二氧-3-哌啶基)1H-異吲哚-1,3-(2H)-二酮[1]。近幾年因其具有抗腫瘤作用套用於臨床抗腫瘤治療，但其抗瘤譜、最佳有效劑量、給藥方式以及最佳的聯合治療方案，均有待進一步研究，作用機制亦不甚明了。為此，我們從基礎實驗角度觀察了沙立度胺對乳腺癌細胞的影響，並初步探討了部分作用機制。
我們採用MTT法來觀察沙立度胺對乳腺癌細胞增殖的影響，預實驗結果表明，沙立度胺的藥理效應與劑量在一定範圍記憶體在劑量-效應關係，但是超過此範圍(200μg/ml)，繼續增加濃度而效應不再繼續增強。我們用MTT做進一步分析所測得的各組抑制率數值發現，沙立度胺的半數細胞增殖抑制濃度(inhibitoryconcentrationgiving50%inhibition,IC50)接近50μg/ml，遠大於20μg/ml，而按照IC50<20μg/ml時，方能判斷樣品在體外對腫瘤細胞有殺傷作用的標準[2]，既然不能判定沙立度胺對乳腺癌細胞有殺傷作用，那么它是通過哪些機制來抑制乳腺癌細胞增殖的呢？
已有報導沙立度胺可以誘導骨髓瘤細胞凋亡，並可使細胞增殖阻滯於G1期[3－4]。於是我們採用了流式細胞術來檢測沙立度胺是否有誘導乳腺癌細胞凋亡的作用。細胞發生凋亡時，DNA斷裂產生小分子量DNA(單、寡聚核小體)溢出胞外，細胞內總DNA量降低，於正常G0/G1細胞群前出現一個DNA低染細胞群，稱“A0細胞群”或“亞G1細胞群”，即凋亡細胞群。實驗結果顯示，經沙立度胺作用後，乳腺癌細胞在DNA直方圖上的G1期峰前顯現細胞凋亡峰亞G1期。100μg/ml沙立度胺處理細胞，MCF-7實驗組細胞凋亡率顯著高於對照組，MDA-MB-231實驗組細胞凋亡率，亦高於對照組，其結果提示誘導凋亡是沙立度胺抑制乳腺癌細胞增殖的機制之一。流式細胞儀分析顯示沙立度胺使G0/G1期細胞增多，G1期又稱DNA複製前期，可以產生rRNA、mRNA以及tRNA核蛋白體，為進入S期(DNA合成期)做準備。這表明沙立度胺可以通過阻滯DNA合成進而抑制乳腺癌細胞增殖。
本實驗結果顯示沙立度胺在一定濃度範圍內可以抑制MCF-7和MDA-MB-231細胞增殖，而且該抑制作用並不受細胞雌孕激素受體(ER、PR)狀態的影響(MCF-7細胞ER、PR陽性而MDA-MB-231細胞ER、PR陰性)，這對於ER和PR陰性，或內分泌治療效果差的乳腺癌患者，無疑是一個有吸引力的治療手段。目前沙立度胺由商業研究機構用於乳腺癌臨床Ⅱ期，可望和傳統的細胞毒藥物相結合，成為現有乳腺癌治療手段的良好補充。
病人，男，30歲。2年半來（2000年12月份開始）常於勞累後出現頭暈乏力，活動後心慌，未介意，3個月後無明顯誘因出現全身浮腫，在某駐軍醫院檢查心臟彩超示全心擴大，少量心包積液，二，三尖瓣少量反流，肝脾大，未能明確診斷介紹來我院會診。在我院化驗血常規：WBC4?1×109/L，Hb87g/L，BPC112×109/L，蛋白電泳有M帶，尿本周蛋白陽性，IgG21?9g/L，血漿蛋白電泳γ球蛋白37.1%。骨髓象（首次骨穿2001年2月7日）：增生活躍，紅細胞呈緡錢狀，漿細胞異常增生占23%，其中幼漿占13?5%，外周血漿細胞占5%。確診為多發性骨髓瘤。給予M2方案化療6個療程，症狀體徵消失，心臟恢復正常大小，實驗室檢查血常規、肝功、腎功均正常，尿本周蛋白陰性，免疫球蛋白IgG，IgA，IgD正常。骨髓象：漿細胞在5%以下，且均為成熟漿細胞，達完全緩解。2002年6月骨穿示漿細胞5%，骨髓活檢示漿細胞占50%，復發。給予VAD方案化療3個療程，末次化療結束時間2003-01-20停止，複查骨髓象示成熟漿細胞占2%，無幼稚漿細胞，再次緩解。於2003年2月開始用干擾素，300萬U，皮下注射，1次/隔日；沙立度胺（反應停）300mg，2次/d。於2003年4月17日心電圖示Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅴ1，Ⅴ3，Ⅴ5導聯T波倒置，將沙立度胺減量至400mg/d後心電圖無好轉，沙立度胺用3個月後停用，改用維甲酸治療1個月後心電圖恢復正常。查體：無貧血貌，胸骨無壓痛，雙肺聽診未聞及乾濕囉音，心界不大，心率68次/min，律齊，心音正常。腹平軟，肝脾未觸及。血常規、肝功、腎功均正常，尿本周蛋白陰性，免疫球蛋白IgG，IgA，IgD正常，骨髓象示成熟漿細胞占2%，無幼稚漿細胞。
討論
沙立度胺是一種谷氨酸衍生物，有抗炎、免疫調節作用。因其有止吐、鎮靜作用曾廣泛地套用於早孕反應，後由於該藥的嚴重致畸胎作用，又在60年代初被禁用。近年來，由於其具有抗焦慮、催眠、止吐和止痛及抗血管生成作用，在多種嚴重疾病和症狀的治療中被再次廣泛套用。沙立度胺治療多發性骨髓瘤的主要機制是抑制腫瘤新生血管生成，其在心臟方面的副作用只有心動過緩[1]。國內外尚無沙立度胺可致心肌缺血改變（心電圖T波倒置）的報導。導致心電圖T波倒置的機制可能是它抑制心肌新生血管生成，從而導致心肌缺血—T波倒置。雖然患者骨髓瘤為輕鏈型，易致心肌損害，但患者病後做心電圖一直無異常，可除外之。治療方面，用改善心肌缺血的藥物無效，停用沙立度胺為唯一選擇。
免疫正調控作用實驗
多發性骨髓瘤（MM）的治療目前仍是世界性難題，臨床上缺乏理想的治療方法。自從Singhal等[1]1999年將沙利度胺用於MM的治療取得顯著療效以來，已進行的多個臨床試驗結果顯示，沙利度胺對MM有肯定的作用，約32%-64%的患者可獲得療效，而且副作用小、使用方便、費用小，是臨床上安全、有效、經濟的治療MM的理想藥物。但是，沙利度胺治療MM的機制目前還不清楚，人們公認的沙利度胺的抗腫瘤機制即血管生成抑制作用與臨床的療效間缺乏相關性，在沙利度胺治療有效者未觀察到骨髓微血管密度下降。越來越多的證據表明，免疫調節作用可能是沙利度胺治療多發性骨髓瘤的主要機理。目前，有關沙利度胺治療MM免疫調節機理的報導甚少，我們研究不同濃度的沙利度胺對正常人外周血單個核細胞(PBMNC)增殖、淋巴細胞亞群、細胞因子分泌及其殺傷活性的影響，以期進一步闡明沙利度胺治療MM的機理，為其臨床套用提供理論依據。
材料和方法
臨床資料
正常人10例來源於健康志願者，男6例，女4例，年齡24-56歲，中位數年齡38歲，經體格及相關實驗室檢查確定為健康人。
細胞株、試劑及儀器
人多發性骨髓瘤細胞系RPMI8226購於中國醫學科學院基礎醫學研究所，沙利度胺(商品名：反應停)購於Sigma公司，RPMI1640培養液（10.5g）購於Gibco公司，胎牛血清（100ml）購於杭州四季青生物科技有限公司，淋巴細胞分離液購於上海華精生物科技有限公司，MTT粉購於華美生物工程公司，PHA購於上海伊華醫學科技有限公司，淋巴細胞亞群檢測試劑盒購於美國BectonDickinson公司，人IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10ELISA試劑盒購於北京萊博生物科技有限公司。
沙利度胺的配製
稱取20mg沙利度胺溶於1mlDMSO中，配成沙利度胺貯備液（20mg/ml），臨用前用培養液稀釋至所需濃度。
沙利度胺對PBMNC增殖影響的MTT檢測
無菌抽取健康人外周血20ml，肝素抗凝，用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離單個核細胞，小心吸取各管中間白膜層於另一離心管中，加入氯化胺作用8分鐘，用含10%胎牛血清的RPMI1640洗3遍，調整細胞濃度為3×105/ml，除調零孔外，每孔需加入PHA1μl(1mg/ml)，使各孔PHA終濃度為5μg/ml，將細胞加入96孔圓底培養板中，每孔加入3×104個細胞。設5個沙利度胺濃度組：0.1、1.25、5、20和100μg/ml，每種濃度設3個復孔，同時設陰性對照組、調零孔組及DMSO對照組。沙利度胺稀釋為250μg/ml加入各不同濃度組，每孔終體積為200μl，37℃、5%CO2下培養72小時後，按常規操作步驟進行。然後上酶聯免疫檢測儀，在490nm波長下測各孔吸光度OD值。
外周血單個核細胞的分離方法同上，調整細胞濃度為1×106/ml，每瓶加入2ml。設6個沙利度胺濃度組：0、0.1、1.25、5、20和100μg/ml,並設二甲亞碸組為對照，同時每瓶各加PHA2μl（12.5mg/ml），每瓶終體積為5ml，各瓶PHA終濃度為5μg/ml。細胞在含10%胎牛血清、2mmol/L谷氨醯胺、100U/ml青黴素及鏈黴素的RPMI1640培養液中於37℃、5%CO2下培養72小時，然後收穫各培養瓶中的細胞，用0.01mol/LPBS洗1遍，調整細胞濃度為5×106/ml，檢測按FACS檢測淋巴細胞亞群試劑盒操作說明進行。
沙利度胺對PBMNC殺傷活性影響的MTT檢測
以外周血單個核細胞為效應細胞，調整細胞濃度分別為106/ml、2×106/ml及4×106/ml；以對數生長期的RPMI8226細胞為靶細胞，調整細胞濃度為105/ml；共設2組，分別為陰性對照組及沙利度胺組（5μg/ml），同時設立效應細胞對照、靶細胞對照、加沙利度胺的靶細胞對照（5μg/ml）和RPMI1640調零孔。除靶細胞對照和調零孔外，其餘各孔加入PHA1μl（1mg/ml），在96孔培養板中每孔加入效應細胞、靶細胞各50μl，每孔設3個復孔，終體積為200μl，共設3個效靶比，分別為10∶1、20∶1、40∶1，每組10個樣本。37℃、5%CO2下培養72小時，操作按常規步驟進行。按下列公式計算殺傷百分比。
殺傷百分比=[1-（ODE+T-ODE）÷ODT]×100%
統計學分析
