基本介紹
- 中文名：草酸銨結晶紫染液
- 外文名：Crystal Violet Staining Solution
- 類別：組織或細胞染色
- 用於：革蘭氏染色
配製,實驗研究,摘要,材料與方法,結果,討論,
配製
草酸銨結晶紫染液的配製：
溶液A | 溶液B |
結晶紫 2克 95%酒精 20毫升 | 草酸銨 0.8克 蒸餾水 80毫升 |
1.將A、B溶液混合，用濾紙過濾後即可使用。
2.結晶紫滴一滴即可，不需多用，以避免污染桌面及手指。
結晶紫染色法測定細胞數
1．在96孔細胞培養板各孔中加0.1ml含5×104～10×4 WEHI-164細胞的培養液（含10%小牛血清的RPMI-1640培養液），37℃ 5% CO2的二氧化碳培養箱中培養2～3小時，讓細胞帖壁。
2．用RPMI-1640培養液10倍遞次稀釋TNF標準品，根據需要3～5倍遞次稀釋待檢樣品，每孔加0.1ml稀釋的標準品或待檢樣品，每個稀釋度3個重複孔。對照孔6個，3個陽性對照孔各加0.1ml含4μg TNF的RPMI-1640培養液，3個陰性對照孔各加100μl RPMI-1640培養液。繼續培養18～24小時。
3．甩去培養液，用PBS小心洗滌一次，每孔加0.1ml 10%甲醇溶液固定細胞30秒鐘。
4．吸去甲醇溶液，每孔加0.1ml結晶紫染液，室溫中放置20分鐘。
5．輕輕甩去染色液，用蒸餾水洗滌各孔，將培養板倒置於吸水紙上吸乾水分。自然乾燥或37℃烘乾。此板可以在室溫中長期保存。
實驗研究
摘要
目的 探討活體細菌著色檢測的適宜條件。方法 將金黃色葡萄球菌、黃色微球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌稀釋濃度為5×107菌落形成單位/毫升 (Colony forming unit，CFU/ml)。 經不同濃度與作用時間的結晶紫(Crystal Violet , CV)著色細菌洗滌後，保存於甘油磷酸緩衝液。採用平皿傾注法測取細菌的CFU。結果 與對照組相比，2%CV染色時，細菌CFU無顯著性差異（P>0.05），染料大於此濃度染色時，CFU有差異性（P<0.05）。染色時間在3min內CFU無顯著性差異（P>0.05）。30%甘油磷酸鹽緩衝液保存著色活體細菌，在48h內活性無顯著性差異（P>0.05），60h後有差異性（P<0.05）。結論 實驗方法適用於活體細菌顯色法的形態學檢測。
結晶紫活體細菌染色
THE EXPERIMENTAL STUDY OF THE LIVING BACTERIA
BY CRYSTAL VIOLET STAINING
Lu Dongming，Yang Dawu, Zhong Zhiqun， Li Yanjun
Qinghai University Medical College
Abstract Objective To explore an appropriate condition for the examination of the living bacteria staining. Methods The culture of Staphylococcus aureus, Micrococcus flavus, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa were collected and then centrifugally washed. The final concentration is 5×107 colony forming unit/milliliter(CFU/ml) diluted by normal saline(NS). The four strains of bacteria were preserved in the glycerophosphate buffer after being dyed and laved by the different concentration and acting time of crystal violet. In order to know the effect of various factors such as staining solution concentration, acting time, and glycerin buffer fabrication upon the bacterial survival rate, and two methods were carried out. One was observed by the microscope, the other was put into the culture dish. Results Comparing with that of the control group, the bacterial CFU was had no statistical significance (P>0.05) dyed by 2% crystal violet. When the concentration of the dye-solution was higher than 2%, there showed the difference (P<0.05). In 3 min dyeing time, CFU had no significant difference (P>0.05). The stained living bacteria preserved in the 30% glycerophosphate buffer within 48h have not shown significant difference (P>0.05),while after 60h, it showed significant difference (P<0.05). Conclusion The method is quite suitable for the morphological detection of the living bacteria.
Key Words Crystal Violet Living bacteria Staining
染色法著色滅活菌是細菌形態學檢測的常用方法，廣泛套用於臨床實驗室。而活體細菌的著色檢測有實際套用價值。為此我們首次通過苯胺染料結晶紫染色細菌，探討活體細菌著色的最佳濃度和染色時間，並對細菌保存液加以改進，旨在為活體細菌染色的形態學檢測建立方法。
材料與方法
1.1 材料
1.1.2 主要試劑與器材：CV染料配製;稱取CV 2.0 g、2.5 g、3.0 g和3.5 g分別溶於95%無水乙醇10 ml ，加入90 ml 0.8%草酸銨溶液，製備成不同濃度的染液。 30%甘油磷酸鹽緩衝液配製：純甘油30 ml，1%磷酸鈉溶液70 ml，硫代硫酸鈉10 mg。5×107 CFU/ml麥氏細菌比濁管 購自青海省醫藥公司。營養瓊脂培養基購自上海生物製品所。CX21型Olympus生物顯微鏡，日本產；SPE-250BS型細菌生化培養箱，上海產。
1.2 方法
1.2.1 實驗細菌分組與處理：將金黃色葡萄球菌，黃色微球菌，大腸埃希菌和銅綠假單胞菌製備成菌液，經NS離心（4000r/min 10min）洗滌3次。根據文獻[1]用NS配製各細菌濃度（5×107CFU/ml）。實驗組每種細菌各分4株,均以8ml分裝於10ml試管內, 離心（4000r/min 10min）留取細菌沉澱物0.5 ml,加入染液0.5 ml 染色。設CV為2.0%、2.5%、3.0%和3.5%濃度染色組。經離心洗滌後,加入30%甘油磷酸鹽緩衝液8 ml保存備用。對照組不加染液以同樣方法操作。
1.2.2 指標檢測： CV濃度和染色時間與細菌存活率及甘油磷酸鹽緩衝液對細菌活力影響測定,均採用平皿傾注法。細菌動力檢測採用(懸滴法)鏡下觀察。
結果
2.1 結晶紫耐性實驗結果（見表1～2）
2%濃度染色細菌3 min時活性不減，與對照組相比CFU無顯著性差異（P>0.05）。在革蘭氏陽性菌染料濃度>2.5%、陰性菌>3.0%、染色時間>4 min染色時，細菌CFU有差異性（P<0.05）。 表1細菌在不同濃度CV著色時的活性比較結果 註：*與對照組相比有統計學意義（P<0.05）.表22%CV不同著色時間的細菌存活率比較結果註：*與對照組相比有統計學意義（P<0.05）
2.2 甘油磷酸鹽緩衝液對細菌活性影響（見表3～4）
甘油濃度50%時CFU有差異性（P0.05）。而由30%甘油磷酸鹽緩衝液所保存的著色細菌在48 h內其活性無顯著性變化（P>0.05），60 h後有變化（P<0.05）。表3不同甘油濃度的磷酸鹽緩衝液對著色菌活性影響比較結果（ 註：*與對照組相比有統計學意義 （P<0.05）.表430%甘油緩衝液保藏著色菌的存活率比較結果 註：*與對照組相比有統計學意義 （P<0.05）.
討論
CV是分子量為408da的人工苯胺染料,分子中有色基團通過正電荷的助色基團與細菌胞漿中帶負電荷的多相膠體成分靜電親和而著色,高濃度結晶紫可抑制細菌代謝的重要酶蛋白,成為導致細菌著色後滅活的重要因素[2]。故著色細菌的活性與染料濃度、染色時間密切相關。我們通過結晶紫染料耐性實驗表明,將2%CV著色革蘭陽性菌的葡萄球菌和黃色微球菌與革蘭陰性菌的大腸埃希菌和銅綠假單胞菌染色3 min並保存於改良的30%甘油磷酸鹽緩衝液中。 著色細菌鏡下觀測保存液中其細菌胞漿色澤均勻、動力及活性在48 h內無顯著性差異（P>0.05）。 適用於實驗室活體細菌染色法的形態學檢測,以及活體細菌色澤標記的生物學研究。
實驗中發現著色細菌60 h後對染料有不同程度的脫色作用(著色細菌色澤逐漸變淡,細菌保藏液色澤變濃),我們認為是活體細菌通過胞吐作用外排染料的結果,這可能也是著色細菌得以存活的重要機制。其原因為著色的活體細菌在代謝過程中產生的有機酸改變了細菌胞漿內等電點,使著色染料與胞漿中多相膠體成分解離所致。
主要用途
GENMED結晶紫細胞染色試劑是一種旨在使粘附生長的單細胞層細胞（群落）攝取結晶紫染料而獲得細胞繁殖密度定量信息的廣譜染色材料和權威而經典的技術方法。該技術由大師級科學家精心研製、成功實驗證明、頂級雜誌推薦的。其適用的細胞是呈單細胞層（Monolayer）生長的人體和動物細胞。產品嚴格無菌，即到即用，性能長期穩定，細胞著色率100%。
技術背景
結晶紫也可稱之為龍膽紫。當它溶解後，可以被活細胞攝入。同時可以使DNA、蛋白質、脂肪著色。染色顯示細胞核呈藍色，細胞質呈粉紅色。肉眼顯示整個細胞呈深藍色。在分光光度計或酶標儀上可以進行定量分析以評價細胞生長繁殖情況。
產品內容
GENMED清理液（Reagent A） 毫升
GENMED染色液（Reagent B） 毫升
GENMED溶解液（Reagent C） 毫升
產品說明書 1份
保存方式
GENMED清理液（Reagent A）保存在4℃冰櫃里，其餘的保存在室溫下；GENMED染色液（Reagent B），避免光照，有效保證1年
用戶自備
封口膜：用於密封培養板後長期保存
顯微鏡：用於觀察細胞染色情況
分光光度計：用於定量檢測細胞生長繁殖情況
實驗步驟
1． 小心抽掉多孔細胞培養板里的培養液
2． 輕輕加入適量的GENMED清理液（Reagent A）到每個培養孔里（見下表）
多孔培養板 | 容量 |
3． 小心抽去清理液
4． 加入適量的GENMED染色液（Reagent B）到每個培養孔里（見下表）
多孔培養板 | 容量 |
5． 在室溫下靜置 分鐘
6． 抽去GENMED染色液（Reagent B）
7． 重複實驗步驟 和 三次，培養孔顯示粉紅色
8． 抽去所有液體，倒置培養板在紙巾上，使其吸乾培養孔里的殘存液體
9． 肉眼或顯微鏡觀察：細胞核呈藍色，細胞質呈粉紅色。整個細胞呈深藍色
10．用封口膜密封培養板，在室溫下長時間保存
11．如果重新啟封觀察，發現樣本乾枯或收縮，只需加上適量的GENMED清理液（Reagent A）則可
12．如果需要定量測試，加上適量的GENMED溶解液（Reagent C）（見下表）
多孔培養板 | 容量 |
13．輕輕搖動培養板，直到GENMED溶解液（Reagent C）均勻分布
14．在室溫下，孵育 分鐘
15．即刻放進分光光度計測讀，波長為 nm
注意事項
1． 本產品為250次（24孔板）、500次（48孔板）、1000次（96孔板）操作
2． 細胞染色前後的清洗過程中，小心操作，以免將細胞沖洗掉，而影響定量分析
3． 在細胞清洗過程中，可以將培養板整個翻轉，一次性傾倒其染色液和清洗液
4． 本公司提供系列細胞繁殖檢測試劑產品
質量標準
1． 本產品經鑑定性能長期穩定
2． 本產品經鑑定效果滿意，細胞固著力強，著色率100%
