微生物染色

微生物染色分HE染色和TC染色。 HE染色是組織學、胚胎學、病理學教學與科研中最基本、使用最廣泛的技術方法。 TTC染色是TTC和活細胞線粒體內的琥珀酸脫氫酶反應，生成紅色的甲月贊，用來表示細胞的活力。配製多為2%，染色要避光，37度條件下，它是評價腦缺血損傷常用的指標。

基本介紹

• 中文名：微生物染色
• 類型：專業用語
• 原理：物理因素和化學因素的作用而進行
• 隸屬：生物學

基本原理

微生物染色的基本原理，是藉助物理因素和化學因素的作用而進行的。物理因素如細胞及細胞物質對染料的毛細現象、滲透、吸附作用等。化學因素則是根據細胞物質和染料的不同性質而發生地各種化學反應。酸性物質對於鹼性染料較易吸附，且吸附作用穩固；同樣，鹼性物質對酸性染料較易於吸附。如酸性物質細胞核對於鹼性染料就有化學親和力，易於吸附。但是，要使酸性物質染上酸性材料，必須把它們的物理形式加以改變（如改變pH值），才利於吸附作用的發生。相反，鹼性物質（如細胞質）通常僅能染上酸性染料，若把它們變為適宜的物理形式，也同樣能與鹼性染料發生吸附作用。

細菌的等電點較低，pH值大約在2—5之間，故在中性、鹼性或弱酸性溶液中，菌體蛋白質電離後帶陰電荷；而鹼性染料電離時染料離子帶陽電。因此，帶陰電的細菌常和帶陽電的鹼性染料進行結合。所以，在細菌學上常用鹼性染料進行染色。

影響因素

有菌體細胞的構造和其外膜的通透性，如細胞膜的通透性、膜孔的大小和細胞結構完整與否，在染色上都起一定作用。此外，培養基的組成、菌令、染色液中的電介質含量和pH、溫度、藥物的作用等，也都能影響細菌的染色。

種類和選擇

染料分為天然染料和人工染料兩種。天然染料有胭脂蟲紅、地衣素、石蕊和蘇木素等，它們多從植物體中提取得到，其成分複雜，有些至今還未搞清楚。目前主要採用人工染料，也稱煤焦油染料，多從煤焦油中提取獲得，是苯的衍生物。多數染料為帶色的有機酸或鹼類，難溶於水，而易溶於有機溶劑中。為使它們易溶於水，通常製成鹽類。

染料可按其電離後染料離子所帶電荷的性質，分為酸性染料、鹼性染料、中性（複合）染料和單純染料四大類。

酸性染料

這類染料電離後染料離子帶負電，如伊紅、剛果紅、藻紅、苯胺黑、苦味酸和酸性復紅等，可與鹼性物質結合成鹽。當培養基因糖類分解產酸使pH值下降時，細菌所帶的正電荷增加，這時選擇酸性染料，易被染色。

鹼性染料

這類染料電離後染料離子帶正電，可與酸性物質結合成鹽。微生物實驗室一般常用的鹼性染料有美蘭、甲基紫、結晶紫、鹼性復紅、中性紅、孔雀綠和蕃紅等，在一般的情況下，細菌易被鹼性染料染色。

中性染料

酸性染料與鹼性染料的結合物叫做中性（複合）染料，如瑞脫氏（Wright）染料和基姆薩氏（Gimsa）染料等，後者常用於細胞核的染色。

單純染料

這類染料的化學親和力低，不能和被染的物質生成鹽，其染色能力視其是否溶於被染物而定，因為它們大多數都屬於偶氮化合物，不溶於水，但溶於脂肪溶劑中，如紫丹類（Sudanb）的染料。

基本程式

微生物的染色方法很多，各種方法套用的染料也不盡相同，但是一般染色都要通過製片及一套染色操作程式。

製片

在乾淨的載玻片上滴上一滴蒸餾水，用接種環進行無菌操作，挑取培養物少許，置載玻片的水滴中，與水混合做成懸液並塗成直徑約1厘米的薄層，為避免因菌數過多聚成集團，不利觀察個體形態，可在載玻片之一側再加一滴水，從已塗布的菌液中再取一環於此水滴中進行稀釋，塗布成薄層，若材料為液體培養物或固體培養物中洗下製備的菌液，則直接塗布於載玻片上即可。

自然乾燥

塗片最好在室溫下使其自然乾燥，有時為了使之幹得更快些，可將標本面向上，手持載玻片一端的兩側，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發，但切勿緊靠火焰或加熱時間過長，以防標本烤枯而變形。

固定

標本乾燥後即進行固定，固定的目的有三個：

1）殺死微生物，固定細胞結構。

2）保證菌體能更牢的粘附在載玻片上，防止標本被水沖洗掉。

3）改變染料對細胞的通透性，因為死的原生質比活的原生質易於染色。

固定常常利用高溫，手執載玻片的一端（塗有標本的遠端），標本向上，在酒精燈火焰外層儘快的來回通過3—4次，共約2—3秒鐘，並不時以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超過60℃）,放置待冷後，進行染色。

以上這種固定法在微生物實驗室中雖然套用較多普遍，但是應當指出，在研究微生物細胞結構時不適用，應採用化學固定法。化學固定法最常用的固定劑有：酒精（95%），酒精和醚各半的混合物，丙酮，1—2%的餓酸等。餓酸能很快固定細胞但不改變其結構，故較常用。套用餓酸固定細胞的技術如下：在培養皿中放一玻璃，在玻璃上放置玻璃毛細管，在毛細管中注入少量的1—2%餓酸溶液，同時在玻璃上再放置濕標本塗片的載玻片，然後把培養皿蓋上，經過1—2分鐘後把標本從培養皿中取出，並使之乾燥。

染色

標本固定後，滴加染色液。染色的時間各不相同，視標本與染料的性質而定，有時染色時還要加熱。染料作用標本的時間平均約1—3分鐘，而所有的染色時間內，整個塗片（或有標本的部分）應該浸在染料之中。

若作複合染色，在媒染處理時，媒染劑與染料形成不溶性化合物，可增加染料和細菌的親和力。一般固定後媒染，但也可以結合固定或染色同時進行。

脫色

用醇類或酸類處理染色的細胞，使之脫色。可檢查染料與細胞結合的穩定程度，鑑別不同種類的細菌。常用的脫色劑是95%酒精和3%鹽酸溶液。

復染

脫色後再用一種染色劑進行染色，與不被脫色部位形成鮮明的對照，便於觀察。革氏染色在酒精脫色後用番紅，石碳酸復紅最後進行染色，就是復染。

水洗

染色到一定的時候，用細小的水流從標本的背面把多餘的染料沖洗掉，被菌體吸附的染料則保留。

乾燥

著色標本洗淨後，將標本晾乾，或用吸水紙把多餘的水吸去，然後晾乾或微熱烘乾，用吸水紙時，切勿使載玻片翻轉，以免將菌體擦掉。

鏡檢

乾燥後的標本可用顯微鏡觀察。

綜上所述，染色的基本程式如下：

製片→固定→媒染→染色→脫色→復染→水洗→乾燥→鏡檢。

染色方法

微生物染色方法一般分為單染色法和復染色法兩種。前者用一種染料使微生物染色，但不能鑑別微生物。復染色法是用兩種或兩種以上染料，有協助鑑別微生物的作用。故亦稱鑑別染色法。常用的復染色法有革蘭氏染色法和抗酸性染色法，此外還有鑑別細胞各部分結構的（如芽胞、鞭毛、細胞核等）特殊染色法。食品微生物檢驗中常用的是單染色法和革蘭氏染色法。

單染色法

用一種染色劑對塗片進行染色，簡便易行，適於進行微生物的形態觀察。在一般情況下，細菌菌體多帶負電荷，易於和帶正電荷的鹼性染料結合而被染色。因此，常用鹼性染料進行單染色，如美蘭、孔雀綠、鹼性復紅、結晶紫和中性紅等。若使用酸性染料，多用剛果紅、伊紅、藻紅和酸性品紅等。使用酸性染料時，必須降低染液的PH值，使其呈現強酸性（低於細菌菌體等電點），讓菌體帶正電荷，才易於被酸性染料染色。

單染色一般要經過塗片、固定、染色、水洗和乾燥五個步驟。

染色結果依染料不同而不同：

石碳酸復紅染色液：著色快，時間短，菌體呈紅色。

美蘭染色液：著色慢，時間長，效果清晰，菌體呈藍色。

草酸銨結晶染色液：染色迅速，著色深，菌體呈紫色。

革蘭氏染色法

革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種鑑別染色法，1884年由丹麥醫師Gram創立。

細菌先經鹼性染料結晶染色，而經碘液媒染後，用酒精脫色，在一定條件下有的細菌此色不被脫去，有的可被脫去，因此可把細菌分為兩大類，前者叫做革蘭氏陽性菌（G+），後者為革蘭氏陰性菌（G—）。為觀察方便，脫色後再用一種紅色染料如鹼性蕃紅等進行復染。陽性菌仍帶紫色，陰性菌則被染上紅色。有芽胞的桿菌和絕大多數和球菌，以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏正反應；弧菌，螺旋體和大多數致病性的無芽胞桿菌都呈現負反應。

革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌在化學組成和生理性質上有很多差別，染色反應不一樣。現在一般認為革蘭氏陽性菌體內含有特殊的核蛋白質鎂鹽與多糖的複合物，它與碘和結晶紫的複合物結合很牢，不易脫色，陰性菌複合物結合程度底，吸附染料差，易脫色，這是染色反應的主要依據。

另外，陽性菌菌體等電點較陰性菌為低，在相同PH條件下進行染色，陽性菌吸附鹼性染料很多，因此不易脫去，陰性菌則相反。所以染色時的條件要嚴格控制。例如，在強鹼的條件下進行染色，兩類菌吸附鹼性染料都多，都可呈正反應；PH很低時，則可都呈負反應。此外，兩類菌的細胞壁等對結晶紫—碘複合物的通透性也不一致，陽性菌透性小，故不易被脫色，陰性菌透性大，易脫色。所以脫色時間，脫色方法也應嚴格控制。

染色機制

對細菌細胞壁的詳細分析，為解釋革蘭氏染色的機制提供了較充分的基礎。目前多用物理機制來解釋革蘭氏染色現象。革蘭氏染色結果的差異主要基於細菌細胞壁的構造和化學組分不同。通過初染和媒染，在細菌細胞膜或原生質體上染上了不溶於水的結晶紫與碘的大分子複合物。G+ 細菌由於細胞壁較厚、肽聚糖含量較高和交聯緊密，故用乙醇洗脫時，肽聚糖層網孔會因脫水而明顯收縮，再加上的G+ 細菌細胞壁基本上不含類脂，故乙醇處理不能在壁上溶出縫隙，因此，結晶紫與碘複合物仍牢牢阻留在其細胞壁內，使其呈現藍紫色。G- 細菌因其細胞壁薄、肽聚糖含量低和交聯鬆散，故遇乙醇後，肽聚糖層網孔不易收縮，加上它的類脂含量高，所以當乙醇將類脂溶解後，在細胞壁上就會出現較大的縫，這樣結晶紫與碘的複合物就極易被溶出細胞壁。因此，通過乙醇脫色，細胞又呈現無色。這時，再經番紅等紅色染料復染，就使G- 細菌獲得了新的顏色——紅色，而G+ 細菌則仍呈藍紫色（實為紫中帶紅）。?

染色要點

1、 待檢菌菌齡應為18-24小時。一般情況下，革蘭氏陰性菌的染色反應較為穩定，不易受菌齡的長短影響；而革蘭氏陽性菌，有的在幼齡時呈陽性，超過24小時可變為陰性。故培養物越陳舊，菌細胞衰老、死亡，則染色常為陰性，造成錯判。

2、 塗片以勻薄為佳，切不可濃厚。過於密集的菌體，因洗脫不勻常呈假陽性。鏡檢革蘭氏染色反應時，要以分散開的細菌著色為準。塗片後不宜用火焰烤乾，宜自然乾燥；若經火焰固定時，應以不燙手為度，以免菌體受損，致使染色反應不準。

3、 革蘭染色操作的關鍵步驟是對脫色的掌握，脫色時間不足，革蘭氏陰性菌可染成陽性菌；脫色過度，革蘭陽性菌會染成陰性菌。故應注意掌握，以無紫色脫出時立即水洗。脫色時間按塗沫厚薄、塗片含水量多少適當掌握，塗沫厚、塗片含水少（水洗後瀝乾水分）時，脫色時間稍長；塗沫薄、塗片含水量多（未瀝乾）時，脫色時間稍短，在20-30秒內調整。

4、 碘液配製後，應裝在密閉的暗色瓶內儲存。如因儲存不當，部分碘將被揮發或被還原，試液由原來的紅棕色變為淡黃色，以至影響固定甲紫的作用，故不宜再用。

5、 革蘭氏染色能否獲得滿意的結果，與操作者的經驗有很大關係。操作沒有把握或對染液有懷疑時，應以對照菌同時染色。

具體操作方法

1）塗片固定。

2）草酸銨結晶紫染1分鐘。

3）自來水沖洗。

4）加碘液覆蓋塗面染1分鐘。

5）水洗，用吸水紙吸去水分。

6）加95%酒精數滴，並輕輕搖動進行脫色，30秒後水洗，吸去水分。

7）蕃紅梁色液（稀）染10秒鐘後，自來水沖洗。乾燥，鏡檢。

染色的結果，革蘭氏正反應菌體都呈紫色，負反應菌體都呈紅色。

注意事項

微生物檢驗的重要技能之一就是塗片、染色、鏡檢。

很多塗片鏡檢與培養結果不符以及鑑定不準的重要原因就是在塗片操作中不規範造成的，當然技術原因也相當重要。

1.載玻片的準備，做細菌塗片尤其是做鞭毛染色，應該用經95%酒精浸泡24h以上的新玻片；

2.塗片，體液應離心集菌，膿、痰、分泌物要求塗到單層細胞厚度（TB要塗厚片），菌落塗片要求菌量要少，因為不止要看染色性狀和菌體形狀，還要觀察菌體排列方式，最好 >10個細菌/油鏡視野，初學者大多塗菌過多，這也是挨批的主要原因；

3.固定，一般要求塗片是自然風乾，經火焰固定時不可過熱（前面有帖討論過），鞭毛染色塗片自然風乾固定即可。