莢膜是包圍在細菌細胞外面的一層粘液性物質，其主要成分是多糖類，不易被染色，故常用襯托染色法，即將菌體和背景著色，而把不著色且透明的莢膜襯托出來。莢膜很薄，易變形，因此，製片時一般不用熱固定。莢膜染色主要用於炭疽桿菌病料的莢膜檢查。
基本介紹
- 中文名：莢膜染色法
- 檢驗對象：炭疽桿菌
- 用途：病料的莢膜檢查
- 原理：把不著色且透明的莢膜襯托出來
- 顏色：莢膜則染成淡薔薇色
- 步驟：塗片、乾燥、固定等
基本原理,操作步驟,主要類型,
基本原理
莢膜是包圍在細菌細胞外面的一層粘液性物質，其主要成分是多糖類，不易被染色，故常用襯托染色法，即將菌體和背景著色，而把不著色且透明的莢膜襯托出來。莢膜很薄，易變形，因此，製片時一般不用熱固定。
莢膜染色主要用於炭疽桿菌病料的莢膜檢查。因為炭疽桿菌莢膜系由d-谷氨酸組成的多肽所構成，而菌體的主要成分則為核蛋白，因二者著色力不同，染色水洗後，則可把莢膜上一部分染料沖洗掉，顏色變淡，故顯微鏡檢查時，在著色較深的菌體周圍看到一圈呈淡紫色的膜，即莢膜。又因鹼性美蘭是一種多染性染料，故菌體染為藍色，莢膜則染成淡薔薇色。
操作步驟
1.塗片：在潔淨無油膩的玻片中央放一小滴蒸餾水（或用接種環挑1-2滴水），用無菌的接種環挑取少量菌種與水滴充分混勻，塗成極薄的菌膜，塗布面積約1cm2 。
2.乾燥：塗片在室溫下使其自然乾燥，也可以小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發，但切勿緊靠火焰或加熱時間過長，以防標本烤枯而變形。
3.固定：手執玻片一端，有菌膜的一面朝上，通過微火三次（手指觸摸反面不燙手為宜），待玻片冷卻後，再加染色液。
4.染色：玻片置於玻片擱架上，加適量（以蓋滿菌膜為度）草酸銨結晶紫（或石炭酸復紅染液）於菌膜部位，染色1-2min。
5.水洗：斜置載玻片，在自來水龍頭（或洗瓶）下用小股水流沖洗，直至洗下的水呈無色為止。
6.乾燥：自然乾燥或用吸水紙吸去塗片上的水，用吸水紙時切勿將菌體擦掉。
7.鏡檢：用高倍鏡和油鏡觀察並繪細菌形態並繪圖於記錄表中。
主要類型
（1）黑斯莢膜染色法
①在莢膜菌塗片上（在空氣中自然乾燥，無需加熱固定）放一小塊濾紙片，之後滴加結晶紫染液。
②在火焰上微微加熱，使玻片上染液冒蒸汽為止。
③用200g/l硫酸銅水溶液沖洗染液，切勿用流水沖洗。用吸水紙吸乾後油鏡檢查。
結果：菌體呈紫色，莢膜呈淡紫色或無色。
①在莢膜菌塗片上（在空氣中自然乾燥，無需加熱固定）放一小塊濾紙片，之後滴加結晶紫染液。
②在火焰上微微加熱，使玻片上染液冒蒸汽為止。
③用200g/l硫酸銅水溶液沖洗染液，切勿用流水沖洗。用吸水紙吸乾後油鏡檢查。
結果：菌體呈紫色，莢膜呈淡紫色或無色。
（2）密爾莢膜染色法
①製片。常規法製片，乾後加熱固定。
②染色。加石炭酸復紅液。微加熱染1min，水洗。
③媒染。加特殊媒染劑，作用0.5min，水洗。
④復染。加鹼性美藍液，染1min，水洗。
⑤鏡檢。乾後油鏡檢查。
結果：菌體呈鮮紅色，莢膜呈藍色。
①製片。常規法製片，乾後加熱固定。
②染色。加石炭酸復紅液。微加熱染1min，水洗。
③媒染。加特殊媒染劑，作用0.5min，水洗。
④復染。加鹼性美藍液，染1min，水洗。
⑤鏡檢。乾後油鏡檢查。
結果：菌體呈鮮紅色，莢膜呈藍色。
（3）奧爾特莢膜染色法塗片、自然乾燥、火焰固定後滴加染液，經火焰加溫使染液產生蒸汽後，繼續染3min，水洗，待乾，鏡檢。
結果：菌體呈赤褐色，莢膜呈黃色。
結果：菌體呈赤褐色，莢膜呈黃色。
（4）濕墨水負染法
①加一滴墨水於潔淨的載玻片上，然後挑取少量菌體與其混合均勻。
②將一潔淨蓋玻片蓋在混合液上，然後在蓋玻片上放一張濾紙，輕輕按壓以吸去多餘的混合液。加蓋玻片時勿產生氣泡，以免影響觀察。
③高倍鏡或油鏡檢查。
結果：背景灰色，菌體較暗，在菌體周圍呈現明亮的透明圈。
①加一滴墨水於潔淨的載玻片上，然後挑取少量菌體與其混合均勻。
②將一潔淨蓋玻片蓋在混合液上，然後在蓋玻片上放一張濾紙，輕輕按壓以吸去多餘的混合液。加蓋玻片時勿產生氣泡，以免影響觀察。
③高倍鏡或油鏡檢查。
結果：背景灰色，菌體較暗，在菌體周圍呈現明亮的透明圈。
（5）乾墨水負染法
①加一滴60g/l葡萄糖液於潔淨載玻片的一端，然後挑取少量菌體與其混合，再加一環墨水，充分混勻。
②另取一端邊緣光滑的載玻片作推片，將推片一端的邊緣置於混合液前方，然後稍向後拉，當推片與混合液接觸後，輕輕左右移動，使之沿推片接觸的後緣散開，爾後以大約30°角迅速將混合液推向玻片另一端，使混合液鋪成薄層。
③空氣中自然乾燥。
④用甲醇浸沒塗片固定1min，棄去甲醇。
⑤在酒精燈上方用文火乾燥。
⑥用甲基紫染1—2min。
⑦用自來水輕輕沖洗，自然乾燥。
⑧高倍鏡或油鏡檢查。
結果：背景灰色，菌體紫色，菌體周圍為清晰透明的莢膜。
①加一滴60g/l葡萄糖液於潔淨載玻片的一端，然後挑取少量菌體與其混合，再加一環墨水，充分混勻。
②另取一端邊緣光滑的載玻片作推片，將推片一端的邊緣置於混合液前方，然後稍向後拉，當推片與混合液接觸後，輕輕左右移動，使之沿推片接觸的後緣散開，爾後以大約30°角迅速將混合液推向玻片另一端，使混合液鋪成薄層。
③空氣中自然乾燥。
④用甲醇浸沒塗片固定1min，棄去甲醇。
⑤在酒精燈上方用文火乾燥。
⑥用甲基紫染1—2min。
⑦用自來水輕輕沖洗，自然乾燥。
⑧高倍鏡或油鏡檢查。
結果：背景灰色，菌體紫色，菌體周圍為清晰透明的莢膜。
（6）石炭酸復紅液染色法
①取培養了72h的莢膜菌製成塗片，自然乾燥（不可用火焰烘乾）。
②滴加1—2滴95%酒精固定（不可加熱固定）。
③加石炭酸復紅染液染色1—2min，水洗，自然乾燥。
④在載玻片一端加一滴墨水，用一塊邊緣光滑的載玻片與墨水接觸，再以勻速推向另端，塗成均勻的一薄層，自然乾燥。
⑤乾燥後用油鏡觀察。
結果：菌體紅色，莢膜無色，背景黑色。
①取培養了72h的莢膜菌製成塗片，自然乾燥（不可用火焰烘乾）。
②滴加1—2滴95%酒精固定（不可加熱固定）。
③加石炭酸復紅染液染色1—2min，水洗，自然乾燥。
④在載玻片一端加一滴墨水，用一塊邊緣光滑的載玻片與墨水接觸，再以勻速推向另端，塗成均勻的一薄層，自然乾燥。
⑤乾燥後用油鏡觀察。
結果：菌體紅色，莢膜無色，背景黑色。
