螢光定量PCR技術

螢光定量PCR最常用的方法是DNA結合染料SYBR GreenⅠ的非特異性方法和Taqman水解探針的特異性方法，在這裡主要介紹這2種方法，其它方法請參考其它螢光定量PCR資料。

與普通PCR的區別

理論上PCR是一個指數增長的過程，但是實際的PCR擴增曲線並不是標準的指數曲線，而是S形曲線。

這是因為隨著PCR循環的增多，擴增規模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各種PCR要素逐漸不敷需求，PCR的效率越來越低，產物增長的速度就逐漸減緩。當所有的Taq酶都被飽和以後，PCR就進入了平台期。由於各種環境因素的複雜相互作用，不同的PCR反應體系進入平台期的時機和平台期的高低都有很大變化，難以精確控制。所以，即使是96次PCR重複實驗，各種條件基本一致，所得結果有很大差異（如下圖），所以在實驗過程中我們不能根據最終PCR產物的量直接計算出起始DNA拷貝數。

螢光定量PCR的方法

接下來我們就來了解一下螢光定量的主要方法，我們如何選擇合適的方法？螢光定量PCR所使用的螢光化學可分為兩種：螢光探針和螢光染料。而螢光定量 PCR 的方法相應的可分為特異類和非特異類兩類，特異性檢測方法是在PCR反應中利用標記螢光染料的基因特異寡核苷酸探針來檢測產物；而非特異性檢測方法是在在PCR反應體系中，加入過量螢光染料，螢光染料特異性地摻入DNA雙鏈後，發射出螢光信號。前者由於增加了探針的識別步驟，特異性更高，但後者則簡便易行。

非特異性SYBR Green I染料法

SYBR Green I是一種結合於所有dsDNA雙螺旋小溝區域的具有綠色激發波長的染料（結合示意圖），在游離狀態下，SYBR Green I發出微弱的螢光，但一旦與雙鏈DNA結合後，螢光大大增強（作用機理圖）。因此，SYBR Green I的螢光信號強度與雙鏈DNA的數量相關，可以根據螢光信號檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數量。

特異性Taqman水解探針法

Taqman螢光定量技術是以Taqman螢光探針為基礎，Taqman螢光探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個螢光發射基團和一個螢光淬滅基團。探針完整時，發射基團發射的螢光信號被淬滅基團吸收；

PCR擴增時，Taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解，使螢光發射基團和螢光淬滅基團分離，從而螢光監測系統可接收到螢光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個螢光分子形成，實現了螢光信號的累積與PCR產物形成完全同步。從而實現定量（如下圖）。常用的螢光基團是FAM, TET, VIC, HEX。