Real-Time PCR 技術，又稱實時定量螢光PCR，是指在PCR反應體系中加入螢光基團，利用螢光信號累積實時監測整個PCR進程，最後通過標準曲線對未知模板進行總量分析或通過Ct值對模板進行相對定量。
基本介紹
- 外文名：real time pcr
- 別名：實時定量螢光PCR
- 提出者：美國Applied Biosystems公司
- 說明：有效解決PCR污染問題
技術原理,常用方法,
技術原理
定量PCR已經從基於凝膠的低通量分析發展到高通量的螢光分析技術，即實時定量PCR。實時螢光定量PCR技術於1996年由美國Applied Biosystems公司推出，由於該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點。實時定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指數擴增期間通過連續監測螢光信號強弱的變化來即時測定特異性產物的量，並據此推斷目的基因的初始量，不需要取出PCR產物進行分離。實時定量PCR作為一個極有效的實驗方法，已被廣泛地套用於分子生物學研究的各個領域。
常用方法
SYBR green（螢光染料摻入法） 和Taqman probe （探針法）
SYBR green:
在PCR反應體系中，加入過量SYBR螢光染料，SYBR螢光染料特異性地摻入DNA雙鏈後，發射螢光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何螢光信號，從而保證螢光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。適用性和特點：
Real-Time PCR流程圖
Real-Time PCR流程圖1、靈敏度高：使用SYBR可使螢光效果增強到1000倍以上
2、通用性好,不需要設計探針,方法簡便,省時,價格低廉。
3、通用型方法，在國內外科研中普遍使用。
4、高通量大規模的定量PCR檢測
5、專一性要求不高的定量PCR檢測。
Taqman Probe:
PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的螢光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告螢光基團和一個淬滅螢光基團。探針完整時，報告基團發射的螢光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告螢光基團和淬滅螢光基團分離，從而螢光監測系統可接收到螢光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個螢光分子形成，實現了螢光信號的累積與PCR產物形成完全同步。
適用性和特點：
1、具有高適應性和可靠性，實驗結果穩定重複性好，特異性更高。
2、適用於擴增序列專一的體系的檢測。
3、樣品中靶基因含量過低的定量PCR檢測。
4、靶基因的特異序列較短，無論怎樣最佳化引物設計條件都不能解決。
5、存在與靶基因同源的序列，在PCR中容易出現非特異性擴增，對特異性要求較高的定量。
6、廣泛用於人類傳染病的診斷和病原定量,在動物病原體基因的檢測,畜禽產品的檢驗檢疫,生物製品的鑑定。
