基本介紹
- 中文名：犬惡絲蟲病
- 英文名：Heartworm disease
病原體,流行病學,症狀,診斷,治療,預防,
病原體
犬惡絲蟲病又名：心絲蟲病 ,形態：雄 10 16cm；雌 25 30cm 形態： 10—16cm 16cm； 25—30cm 白色 、細長。 白色、細長。
宿主：犬、貓、狐、狼 ， 寄生部位：右心室、肺動脈 。
流行病學
症狀
心內膜炎，右心肥大心內膜炎。
循環障礙，以肝、肺為顯。循環障礙，以肝、肺為顯。 早期、少量寄生不明顯。 早期、少量寄生不明顯。
循環障礙引起呼吸困難、貧血、心悸、 循環障礙、引起呼吸困難、貧血、心悸、 心雜音、腹圍增大（腹水）。
心雜音、腹圍增大（腹水）。
結節性皮膚病。
診斷
將犬惡絲蟲成蟲粗製抗原經過凝膠柱層析後進行間接ＥｌＩＳＡ試驗，確定最佳實驗條件，建立犬惡絲蟲病的同種純化抗原ＥＬＩＳＡ診斷法。通過阻斷性試驗、交 叉反應試驗、敏感性和特異性試驗、重複性試驗及與病原學方法比較，評價其效果。 結果 純化抗原ＥＬＩＳＡ方法與 結論 成功建立犬惡 犬鉤蟲和蛔蟲感染犬血清無交叉反應，檢出的陽性血清最高抗體滴度為１：２５ ６００，重複性好。 絲蟲病ＥＩ。ＩＳＡ診斷方法，可替代蟲檢法對犬惡絲蟲病進行早期診斷。
犬惡絲蟲病是由犬惡絲蟲成蟲寄生於犬的右心室及肺動脈（少數見於胸腔、支氣管）引起循環障礙、呼吸困難、貧血、猝死等症狀的一種絲蟲病。該病不僅感染 犬，幾乎所有在發生心絲蟲病區域中未被保護的動物 （貓及其他野生肉食動物等）都有可能被感染，甚至危 害人類健康。 犬惡絲蟲病主要通過血檢微絲蚴確診，該法容易 出現假陰性。酶聯免疫吸附試驗（ＥＩ。ＩＳＡ）是一種特異 性強、敏感性高的血清學方法。
用牛指狀絲蟲檢測犬絲蟲抗體的ＰＰＡ—ＥＬＩＳＡ法和用 牛腹腔絲蟲Ｇ抗原的ＥＬＩＳＡ法診斷犬的絲蟲病。從 理論上講套用同種抗原ＥＩ。ＩＳＡ檢測的血清抗體滴度 最高。因此，本實驗採用犬惡絲蟲成蟲純化抗 原，建立了診斷犬惡絲蟲病的ＥＬＩＳＡ法，結果報導如 下。 ｍｉｎ，取上清，備用。參考陽性血清 犬血液５ ｍ１，３ ０００ 採集丹東地區的犬惡絲蟲感染 ｒ／ｍｉｎ離心５ｍｉｎ，取血清，備用。 ｒ／ｍｉｎ離 １．３鉤蟲感染犬血清無菌采蟲檢微絲蚴陰性、糞檢 其他線蟲陰性、鉤蟲陽性犬血液５ 心５ ｍｉｎ，取血清，備用。 １．４ ｍｌ，３ ０００ 蛔蟲感染犬血清 無菌采蟲檢微絲蚴陰性、糞 ｍｌ，３ ０００ ｒ／ｍｉｎ 檢其他線蟲陰性、蛔蟲陽性犬血液５ 離心５ ｍｉｎ，取血清，備用。 ２抗原的製備 將犬惡絲蟲成蟲用生理鹽水洗淨、剪碎，加入冷 ｐＨ ７．４磷酸鹽緩衝液（ＰＢＳ）研磨，液氮反覆凍融６～８ ０００ 次，超音波粉碎，１０ ｒ／ｍｉｎ離心３０ ｍｉｎ，取上清液， Ｂｒａｄｆｏｒｄ法測定蛋白含量為０．２２５ ｍｇ／ｍｌ。將適當濃 材料和方法 １ 血清 參考陰性血清 採集長春市剛出生的德國牧羊 ｒｎｌ，３ ０００ 。
犬（其母犬蟲檢陰性）血液５ ｒ／ｍｉｎ離心５萬方的上清液裝Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ一２００凝膠柱，用０．０１ ｍｏｌ／Ｉ。 ｐＨ ７．４ 的陽性滴度評價純化抗原的敏感性。 現場對比試驗 在市郊兩個犬惡絲蟲病流行犬 場，分別用蟲體濃集蟲檢法和ＥＩ。ＩＳＡ法檢測犬惡絲蟲 感染率，比較兩種檢測法的陽性率。 結 果 ＰＢＳ洗脫，分別收集各峰洗脫液。共出現２個 洗脫峰，紫外分光光度法測定蛋白含量分別為１峰 ０．０２５ ｍｇ／ｍｌ，２峰為０．０３ ｍｇ／ｍｌ。分裝，一２０℃保 存。
ＩＳＡ方法操作。酶聯葡萄糖球菌Ａ蛋 白（ＨＲＰ—ＳＰＡ）為上海生物製品研究所生產，底物為過 氧化氫一鄰苯二胺。 用酶聯免疫檢測儀測定各孔的Ａ值。計算被檢 血清Ａ值Ｓ與陰性對照血清Ａ值Ｎ的比值。以１５ 份陰性參考血清作１：１５０稀釋後的ＥＬＩＳＡ Ａ值×２ 為陽性界值判定試驗結果。每次每板均設參照陰、陽 性血清和空白對照，以空白調零。診斷抗原的最佳工作濃度 層析１峰抗原ＥＬＩＳＡ Ｓ／Ｎ值＞２．００且肉眼觀察 陰性孔與陽性孑Ｌ顏色差異明顯的最佳稀釋度為１：６４。 層析２峰的抗原性較弱，ＥＩ。ＩＳＡ試驗的Ｓ／Ｎ值較小。 ２血清最佳稀釋度 Ｓ／Ｎ值＞２．００，且肉眼觀察陽性孔與陰性孔差異 明顯的血清最佳稀釋度為１：１６０。本試驗中，血清按 １：１５０稀釋。 試驗的臨界值 酶標ＳＰＡ選取 純化抗原１ １５份參考陰性血清平均Ａ值為０．０３１，因此確定 ０．０６為ＥＩ。ＩＳＡ的臨界值。 ４試驗的特異性和敏感性 檢測參考陽性血清３６份，檢出陽性３３份，符合率 為９１．７％，陽性血清最高滴度為１：２５ ６００。檢測參 考陰性血清１５份，無１份陽性，陰性符合率為１００％。 用１：６４稀釋的層 ５６０ 最佳試驗條件的確定 酶標ＳＰＡ工作濃度的選定 ３．１．１ 推薦濃度，按ｌ：４０倍稀釋。 ３．１．２純化抗原最佳工作濃度的測定 1峰、２峰均作倍比稀釋，陽性和陰性血清分均作１：１００ 稀釋，酶標ＳＰＡ １：４０稀釋，進行ＥＩ。ＩＳＡ試驗，優選 最佳抗原稀釋度。 ３．１．３血清最佳稀釋度的測定 析抗原１峰包被，血清作１：２０、１：４０……、１：２ 佳抗體稀釋度。 ３．２ ５試驗的交叉反應 檢測鉤蟲感染犬血清和蛔蟲感染犬血清各５份， 結果均為陰性。 ６試驗的重複性 １０份參考陰性血清重複檢測２次，平均Ａ值分別 為０．０１２和０．０１６，差異無顯著性（ｔ—Ｏ．５１８４， Ｐ＞０．０５）；１０份陽性血清２次檢測的平均Ａ值分別 為ｏ．２３４和Ｏ．２３７，差異亦無顯著性（ｔ一２．０９４， Ｐ＞Ｏ．０５）。 稀釋，酶標ＳＰＡｌ：４０稀釋，進行ＥＬＩＳＡ反應，優選最 阻斷性試驗 將層析１峰抗原作１：８、１：１６ ……１：４ ０９６稀釋。將５份參考陽性血清等量混合後 取１００“１分別與以上抗原作１：１混合，３７℃孵育３ 在相同條件下進行ＥＬＩＳＡ試驗，分別測定其Ａ值。 ３．３ ｈ 後再各取１００ ｔＡ與相應稀釋度的等量層析１峰抗原 符合率試驗 選取層析１峰抗原、血清、酶標 ７阻斷試驗結果 抗原層析１峰經系列稀釋後作阻斷試驗，１：８、 １：１６稀釋度的ＥＬＩＳＡ Ａ值比阻斷前降低５０％以上。 ８ ＳＰＡ的最佳工作濃度或稀釋濃度檢測參考陰性１５ 份、參考陽性血清３６份，分別測定其Ａ值，根據臨界 值判定試驗結果，計算陰性及陽性符合率。 ３．４交叉反應試驗選取層析１峰抗原、血清、酶標 ＳＰＡ的最佳工作濃度或稀釋濃度檢測蛔蟲、鉤蟲感染 犬血清各５份，根據臨界值判定結果，計算交叉陽性 率。 ３．５重複性試驗取純化抗原、血清、酶標ＳＰＡ的最 佳工作濃度或稀釋濃度，在相同條件下分別檢測１０份 參考陽性血清和１０份陰性血清各２次，分別計算每次 試驗的參考陽性血清和參考陰性血清Ａ值均數，並作 顯著性檢驗。 ３．６敏感性試驗 純化抗原、酶標ＳＰＡ選用最佳工 作濃度。隨機將５份參考陽性血清混合，作１：２００、 １：４００……１：１０２ ４００稀釋後作ＥＬＩＳＡ。根據血清 ＥＬＩＳＡ與蟲檢法比較 用ＥＩ。ＩＳＡ法檢測６２只犬血清抗體，陽性３２只， 陽性率為５１．６％；用濃集法查犬惡絲蟲微絲蚴，１８只 陽性，陽性率為２９．０％，差異有顯著性（ｔ一２．５５０， Ｐ＜Ｏ．０５）。 討 論 本試驗採用同種純化抗原檢測犬惡絲蟲抗體，提 高了ＥＬＩＳＡ方法的特異性和敏感性，檢測犬惡絲蟲感 染犬血清的最高抗體滴度達１：２５ ６００，高於資料報導 的用異種絲蟲純化抗原檢測犬惡絲蟲陽性血清的最高 抗體滴度為１：６ ４００的結果，且不與鉤蟲和蛔蟲感染 犬血清發生交叉反應。
ＩＳＡ方法操作。酶聯葡萄糖球菌Ａ蛋 白（ＨＲＰ—ＳＰＡ）為上海生物製品研究所生產，底物為過 氧化氫一鄰苯二胺。 用酶聯免疫檢測儀測定各孔的Ａ值。計算被檢 血清Ａ值Ｓ與陰性對照血清Ａ值Ｎ的比值。以１５ 份陰性參考血清作１：１５０稀釋後的ＥＬＩＳＡ Ａ值×２ 為陽性界值判定試驗結果。每次每板均設參照陰、陽 性血清和空白對照，以空白調零。診斷抗原的最佳工作濃度 層析１峰抗原ＥＬＩＳＡ Ｓ／Ｎ值＞２．００且肉眼觀察 陰性孔與陽性孑Ｌ顏色差異明顯的最佳稀釋度為１：６４。 層析２峰的抗原性較弱，ＥＩ。ＩＳＡ試驗的Ｓ／Ｎ值較小。 ２血清最佳稀釋度 Ｓ／Ｎ值＞２．００，且肉眼觀察陽性孔與陰性孔差異 明顯的血清最佳稀釋度為１：１６０。本試驗中，血清按 １：１５０稀釋。 試驗的臨界值 酶標ＳＰＡ選取 純化抗原１ １５份參考陰性血清平均Ａ值為０．０３１，因此確定 ０．０６為ＥＩ。ＩＳＡ的臨界值。 ４試驗的特異性和敏感性 檢測參考陽性血清３６份，檢出陽性３３份，符合率 為９１．７％，陽性血清最高滴度為１：２５ ６００。檢測參 考陰性血清１５份，無１份陽性，陰性符合率為１００％。 用１：６４稀釋的層 ５６０ 最佳試驗條件的確定 酶標ＳＰＡ工作濃度的選定 ３．１．１ 推薦濃度，按ｌ：４０倍稀釋。 ３．１．２純化抗原最佳工作濃度的測定 1峰、２峰均作倍比稀釋，陽性和陰性血清分均作１：１００ 稀釋，酶標ＳＰＡ １：４０稀釋，進行ＥＩ。ＩＳＡ試驗，優選 最佳抗原稀釋度。 ３．１．３血清最佳稀釋度的測定 析抗原１峰包被，血清作１：２０、１：４０……、１：２ 佳抗體稀釋度。 ３．２ ５試驗的交叉反應 檢測鉤蟲感染犬血清和蛔蟲感染犬血清各５份， 結果均為陰性。 ６試驗的重複性 １０份參考陰性血清重複檢測２次，平均Ａ值分別 為０．０１２和０．０１６，差異無顯著性（ｔ—Ｏ．５１８４， Ｐ＞０．０５）；１０份陽性血清２次檢測的平均Ａ值分別 為ｏ．２３４和Ｏ．２３７，差異亦無顯著性（ｔ一２．０９４， Ｐ＞Ｏ．０５）。 稀釋，酶標ＳＰＡｌ：４０稀釋，進行ＥＬＩＳＡ反應，優選最 阻斷性試驗 將層析１峰抗原作１：８、１：１６ ……１：４ ０９６稀釋。將５份參考陽性血清等量混合後 取１００“１分別與以上抗原作１：１混合，３７℃孵育３ 在相同條件下進行ＥＬＩＳＡ試驗，分別測定其Ａ值。 ３．３ ｈ 後再各取１００ ｔＡ與相應稀釋度的等量層析１峰抗原 符合率試驗 選取層析１峰抗原、血清、酶標 ７阻斷試驗結果 抗原層析１峰經系列稀釋後作阻斷試驗，１：８、 １：１６稀釋度的ＥＬＩＳＡ Ａ值比阻斷前降低５０％以上。 ８ ＳＰＡ的最佳工作濃度或稀釋濃度檢測參考陰性１５ 份、參考陽性血清３６份，分別測定其Ａ值，根據臨界 值判定試驗結果，計算陰性及陽性符合率。 ３．４交叉反應試驗選取層析１峰抗原、血清、酶標 ＳＰＡ的最佳工作濃度或稀釋濃度檢測蛔蟲、鉤蟲感染 犬血清各５份，根據臨界值判定結果，計算交叉陽性 率。 ３．５重複性試驗取純化抗原、血清、酶標ＳＰＡ的最 佳工作濃度或稀釋濃度，在相同條件下分別檢測１０份 參考陽性血清和１０份陰性血清各２次，分別計算每次 試驗的參考陽性血清和參考陰性血清Ａ值均數，並作 顯著性檢驗。 ３．６敏感性試驗 純化抗原、酶標ＳＰＡ選用最佳工 作濃度。隨機將５份參考陽性血清混合，作１：２００、 １：４００……１：１０２ ４００稀釋後作ＥＬＩＳＡ。根據血清 ＥＬＩＳＡ與蟲檢法比較 用ＥＩ。ＩＳＡ法檢測６２只犬血清抗體，陽性３２只， 陽性率為５１．６％；用濃集法查犬惡絲蟲微絲蚴，１８只 陽性，陽性率為２９．０％，差異有顯著性（ｔ一２．５５０， Ｐ＜Ｏ．０５）。 討 論 本試驗採用同種純化抗原檢測犬惡絲蟲抗體，提 高了ＥＬＩＳＡ方法的特異性和敏感性，檢測犬惡絲蟲感 染犬血清的最高抗體滴度達１：２５ ６００，高於資料報導 的用異種絲蟲純化抗原檢測犬惡絲蟲陽性血清的最高 抗體滴度為１：６ ４００的結果，且不與鉤蟲和蛔蟲感染 犬血清發生交叉反應。
