基本介紹
- 中文名：凝膠層析
- 別名：分子篩過濾、排阻層析
- 原理：蛋白質的分子量不同
- 類別：Sephadex 和Sephacryl
原理,分類,選擇,製備,加樣洗脫,套用,
原理
單個凝膠珠本身象個"篩子"。不同類型凝膠的篩孔的大小不同。如果將這樣的凝膠裝入一個足夠長的柱子中，作成一個凝膠柱。當含有大小不同的蛋白質樣品加到凝膠柱上時，比凝膠珠平均孔徑小的蛋白質就要連續不斷地穿入珠子的內部，這樣的小分子不但其運動路程長，而且受到來自凝膠珠內部的阻力也很大，所以越小的蛋白質，把它們從柱子上洗脫下來所花費的時間越長！凝膠中只有很少的孔徑可接受大的蛋白。因此，大的蛋白質直接通過凝膠珠之間的縫隙首先被洗脫下來。凝膠過濾所用的凝膠孔徑大小的選擇主要取決於要純化的蛋白質分子量。
分類
葡聚糖凝膠中最常見的是Sephadex 系列，它是葡聚糖與3－氯－1，2環氧丙烷(交聯劑)相互交聯而成，交聯度由2環氧丙烷的百分比控制。Sephadex 的主要型號是G-10 ~ G-200，後面的數字是凝膠的吸水率(單位是mL / g 乾膠)乘以10。如Sephadex G-50，表示吸水率是5mL/g 乾膠。Sephadex 的親水性很好，在水中極易膨脹，不同型號的Sephadex 的吸水率不同，它們的孔穴大小和分離範圍也不同。數字越大的，排阻極限越大，分離範圍也越大。Sephadex 中排阻極限最大的G-200為8×10。
Sephadex 在水溶液、鹽溶液、鹼溶液、弱酸溶液以及有機溶液中都是比較穩定的，可以多次重複使用。Sephadex 穩定工作的pH 一般為為2~10。強酸溶液和氧化劑會使交聯的糖苷鍵水解斷裂，所以要避免Sephadex 與強酸和氧化劑接觸。Sephadex 在高溫下穩定，可以煮沸消毒，在100 °C 下40 min 對凝膠的結構和性能都沒有明顯的影響。Sephadex 由於含有羥基基團，故呈弱酸性，這使得它有可能與分離物中的一些帶電基團(尤其是鹼性蛋白)發生吸附作用。但一般在離子強度大於0.05的條件下，幾乎沒有吸附作用。所以在用Sephadex 進行凝膠層析實驗時常使用一定濃度的鹽溶液作為洗脫液，這樣就可以避免Sephadex 與蛋白發生吸附，但應注意如果鹽濃度過高，會引起凝膠柱床體積發生較大的變化。Sephadex 有各種顆粒大小(一般有粗、中、細、超細)可以選擇，一般粗顆粒流速快，但解析度較差；細顆粒流速慢，但解析度高。要根據分離要求來選擇顆粒大小。Sephadex 的機械穩定性相對較差，它不耐壓，解析度高的細顆粒要求流速較慢，所以不能實現快速而高效的分離。另外，Sephadex G-25和G-50中分別加入羥丙基基團反應，形成LH 型烷基化葡聚糖凝膠，主要型號為Sephadex LH-20和LH-60，適用於以有機溶劑為流動相，分離脂溶性物質，例如膽固醇、脂肪酸激素等。
Sephacryl 是葡聚糖與甲叉雙丙烯醯胺(N，N'-methylenebisacrylamide)交聯而成。是一種比較新型的葡聚糖凝膠。Sephacryl 的優點就是它的分離範圍很大，排阻極限甚至可以達到108，遠遠大於Sephadex 的範圍。所以它不僅可以用於分離一般蛋白，也可以用於分離蛋白多糖、質粒、甚至較大的病毒顆粒。 Sephacryl 與Sephadex 相比另一個優點就是它的化學和機械穩定性更高：Sephacryl 在各種溶劑中很少發生溶解或降解，可以用各種去污劑、胍、脲等作為洗脫液，耐高溫，Sephacryl 穩定工作的pH 一般為3~11。另外Sephacryl 的機械性能較好，可以以較高的流速洗脫，比較耐壓，解析度也較高，所以Sephacryl 相比Sephadex 可以實現相對比較快速而且較高解析度的分離。
選擇
根據實驗目的不同選擇不同型號的凝膠。如果實驗目的是將樣品中的大分子物質和小分子物質分開，由於它們在分配係數上有顯著差異，這種分離又稱組別分離，一般可選用Sephadex G-25和G-50，對於小肽和低分子量的物質（1000-5000）的脫鹽可使用Sephadex G-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4。如果實驗目的是將樣品中一些分子量比較近似的物質進行分離，這種分離又叫分級分離。一般選用排阻限度略大於樣品中最高分子量物質的凝膠，層析過程中這些物質都能不同程度地深入到凝膠內部，由於Kd不同，最後得到分離。 根據經驗，組別分離時，大多採用2-30cm長的層析柱，分級分離時，一般需要100cm左右長的層析柱，其直徑在1-5cm範圍內，小於1cm產生管壁效應，大於5cm則稀釋現象嚴重。長度L與直徑D的比值L/D一般宜在7-10之間，但對移動慢的物質宜在30-40之間。
凝膠
凝膠製備
凝膠型號選定後，將乾膠顆粒懸浮於5-10倍量的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹，溶脹之後將極細的小顆粒傾瀉出去。自然溶脹費時較長，加熱可使溶脹加速，即在沸水浴中將濕凝膠漿逐漸升溫至近沸，1-2小時即可達到凝膠的充分脹溶。加熱法既可節省時間又可消毒。
凝膠的裝填：將層析柱與地面垂直固定在架子上，下端流出口用夾子夾緊，柱頂可安裝一個帶有攪拌裝置的較大容器，柱內充滿洗脫液，將凝膠調成較稀薄的漿頭液盛於柱頂的容器中，然後在微微地攪拌下使凝膠下沉於柱內，這樣凝膠粒水平上升，直到所需高度為止，拆除柱頂裝置，用相應的濾紙片輕輕蓋在凝膠床表面。稍放置一段時間，再開始流動平衡，流速應低於層析時所需的流速。在平衡過程中逐漸增加到層析的流速，千萬不能超過最終流速。平衡凝膠床過夜，使用前要檢查層析床是否均勻，有無“紋路”或氣泡，或加一些有色物質來觀察色帶的移動，如帶狹窄、均勻平整說明層析柱的性能良好，色帶出現歪曲、散亂、變寬時必須重新裝柱。
加樣洗脫
凝膠柱的重複使用、凝膠回收與保存
如果不再使用可將其回收，一般方法是將凝膠用水沖洗乾淨濾乾，依次用70%、90%、95%乙醇脫水平衡至乙醇濃度達90%以上，濾乾，再用乙醚洗去乙醇、濾乾、乾燥保存。濕態保存方法是凝膠漿中加入抑菌劑或水沖洗到中性，密封后高壓滅菌保存。
套用
⑴脫鹽：高分子（如蛋白質、核酸、多糖等）溶液中的低分子量雜質，可以用凝膠層析法除去，這一操作稱為脫鹽。本法脫鹽操作簡便、快速、蛋白質和酶類等在脫鹽過程中不易變性。適用的凝膠為SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。柱長與直徑之比為5-15，樣品體積可達柱床體積的25%-30%，為了防止蛋白質脫鹽後溶解度降低會形成沉澱吸附於柱上，一般用醋酸銨等揮發性鹽類緩衝液使層析柱平衡，然後加入樣品，再用同樣緩衝液洗脫，收集的洗脫液用冷凍乾燥法除去揮發性鹽類。
