M13噬菌體

M13噬菌體是一種絲狀噬菌體,內有一個環狀單鏈DNA分子,長6407個核苷酸,含DNA複製和噬菌體增殖所需的遺傳信息

基本介紹

概述,構建,優點,缺點,宿主菌,最新發現,

概述

M13噬菌體是一種絲狀噬菌體,內有一個環狀單鏈DNA分子,長6407個核苷酸,含DNA複製和噬菌體增殖所需的遺傳信息。M13DNA的複製起始位點定位在基因間隔區內。但是基因間隔區的有些核苷酸序列即使發生突變、缺失或插入外源DNA片段,也不會影響M13DNA的複製,這為M13DNA構建克隆載體提供了條件。
其中M13mp系列對野生型M13加以改造,插入了多克隆位點LacZ基因,可容納外源DNA300-400bp,可用於製備DNA測序時用的單鏈模板和核酸探針
M13 噬菌體的生物學 M13 噬菌體顆粒是絲狀的,只感染F+(含F質粒,能產生性菌毛)的大腸桿菌。感染宿主後通常不裂解宿主細胞,而是從感染的細胞中分泌出噬菌體顆粒,宿主細胞仍能繼續生長和分裂。但生長水平比未感染組低。
M13 噬菌體的基因組為單鏈 DNA (+DNA),由 6407 的鹼基組成。基因組 90% 以上的序列可編碼蛋白質,共有 11 個編碼基因,基因之間的間隔區多為幾個鹼基。較大的間隔位於基因 Ⅷ 和基因 Ⅲ 以及基因 Ⅱ 和基因 Ⅳ 之間,其間有調節基因表達和 DNA 合成的元件。
M13 噬菌體基因組可編碼 3 類蛋白質,包括複製蛋白(基因 Ⅱ,Ⅴ 和 Ⅹ),形態發生蛋白(基因Ⅰ,Ⅳ 和 Ⅺ),結構蛋白(基因 Ⅲ 、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ 和 Ⅸ)。所有結構蛋白在形態發生之前都插入在宿主細胞質膜中。基因組 DNA 為正鏈,按基因 Ⅱ 至基因 Ⅳ 方向合成,與噬菌體的 mRNA 序列同義。
在宿主細胞內,感染性的單鏈噬菌體 DNA (正鏈)在宿主酶的作用下轉變成環狀雙鏈 DNA ,用於 DNA 的複製,因此這種雙鏈 DNA 稱為複製型 DNA (replicative form DNA) ,即 RF DNA 。通過 θ 複製方式, RF DNA 進行擴增,基因的轉錄也隨即開始。基因組中的任意一個啟動子都可以啟動基因的轉錄,單方向地終止於下游的終止子。啟動子和終止子的位置關係使得靠近終止子的基因轉錄更頻繁。
當基因 Ⅱ 蛋白在親代 RF DNA 的正鏈特定位點上產生一個切口時,便啟動噬菌體基因組進行滾環複製。此時,在大腸桿菌的 DNA 聚合酶 Ⅰ 的作用下,以負鏈為模板在切口的 3' 末端加入核苷酸,並持續 DNA 的合成,用新合成的 DNA 替換原有的正鏈。當複製叉環繞模板整整一周時,被取代的正鏈由基因 Ⅱ 產物切去,經環化後形成單位長度的噬菌體基因組 DNA 。在感染開始的 15~20 分鐘內,這些子代正鏈在宿主細胞酶的作用下,又轉變成 RF DNA ,然後以之為模板繼續轉錄並繼續合成子代正鏈 DNA 。當感染細胞內累計有 100-200 個 RF DNA 時,細胞內也產生了足夠的單鏈 DNA 結合蛋白,即基因 Ⅴ 蛋白。該蛋白可以抑制翻譯活性,特別是抑制基因 Ⅱ mRNA 的翻譯,並且強烈地結合在新合成的正鏈 DNA 上,阻止其轉化成 RF DNA 。此時, DNA 的合成幾乎只產生子代正鏈 DNA 。另外,基因 Ⅹ 蛋白和基因 Ⅴ 蛋白也是噬菌體特異 DNA 合成的強力抑制子,從而限制感染細胞內 RF DNA 的數量。結果,感染細胞內 RF DNA 的數目和子代正鏈 DNA 的產生速率都能保持適度。
成熟噬菌體顆粒由 11 個病毒蛋白中的 5 個組成,至少 4 個其他蛋白(如基因 Ⅰ 、Ⅳ 和 Ⅺ 蛋白,以及宿主的硫氧還蛋白(thioredoxin)對噬菌體顆粒的組裝和分泌是必須的。
M13沒有包裝限制:

構建

單鏈 DNA 的酶切和連線是比較困難的,因此 M13 噬菌體在用作載體時是利用其雙鏈 RF DNA。RF DNA 很容易從感染細胞中純化出來,可以象質粒一樣進行操作,並可通過轉化方法再次導入細胞。
(1)載體的插入位點
在 M13 噬菌體基因組中絕大多數為必需基因,只有兩個間隔區可用來插入外源 DNA(基因 Ⅱ/Ⅳ 和基因 Ⅷ/Ⅲ 之間)。基因 Ⅱ 和基因 Ⅳ 之間的 508bp 間隔區是主要的外源片段插入位點。在基因 Ⅷ 和基因 Ⅲ 之間的小間隔區也可用來插入外源片段,但是在操作過程中,需要獲得感染細胞的菌落進行影印篩選,比利用可見的噬菌斑方法更慢更麻煩。基因 Ⅹ 也可用來克隆外源片段。
(2)M13 噬菌體載體組成
現在所使用的 M13 噬菌體載體是 Messing 及其同事建立的 mp 系列載體,以基因 Ⅱ 和基因 Ⅳ 之間的區域作為外源 DNA 插入區。
mp 載體系列都是從同一個重組 M13 噬菌體 (M13mpl) 改造而來的。在 M13mpl 載體中,間隔區內的 HaeⅢ 位點插入了一小段大腸桿菌 DNA ,引入 α 互補篩選。
(3)M13載體系列
① M13載體系列的命名:M13mpn,n代表系列數字。
② 對M13mp1的改進:加上常用的酶切位點。如B. Gronenborn和J. Messing1978年把LacZ’ 5’端的第13個核苷酸G突變成A,產生了一個EcoR I切點,構建成M13mp2。
③ 對M13mp2的進一步改進產生了M13mp系列載體。在M13mp2的LacZ’的5‘端加上一段人工合成的多克隆位點MCS)。如M13mp7、M13mp8、M13mp9、M13mp10、M13mp11、M13mp18、M13mp19分別對應於pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18pUC19
(4)M13mpl8 和 M13mpl9
M13mpl8 和 M13mpl9 這兩個載體含有 13 個不同的酶切位點,可供插入由多種各不相同的限制酶切割而成的 DNA 片段。 M13mpl8 和 M13mpl9 DNA 的全序列已經測定完成,這兩種載體只是在 lacZ 區內不對稱的多克隆區的方向上有所不同。
當 RF DNA 被兩種不同的限制酶切割以後, M13mpl8 和 M13mpl9 輕易不能重新環化。僅當連線混合液中含有帶匹配末端的外源雙鏈 DNA片段時,方可閉合成環。這一片段在 M13mpl8 和 M13mpl9 中將以兩個互為相反的方向插入。這樣一來,在 M13mpl8 的正鏈中含有外源 DNA 雙鏈的其中一條鏈,而在 M13mpl9 正鏈中則含有外源 DNA 的另一條鏈,即 M13mpl8 重組體的子代噬菌體內含有外源 DNA 的一條鏈, M13mpl9 重組體的子代噬菌體內則含有它的互補鏈。故用 M13mpl8 和 M13mpl9 作為一對載體,就可能用一個引物 (通用引物),從所插入 DNA 片段的任一端開始,測定互為相反的兩條鏈的 DNA 序列,並可製備只與外源 DNA 的任意一條鏈互補的 DNA 探針。

優點

(1)有MCS,便於克隆不同的酶切片段。
(2) Xgal顯色反應,可供直接選擇。
(3)無包裝限制,克隆能力大。
(4)可以克隆雙鏈DNA分子中的每一條鏈(子代M13噬菌體中包含的是單連+DNA)。

缺點

① 插入外源DNA後,遺傳穩定性顯著下降。
② 實際克隆能力小於1500bp(雖無包裝限制,並非無限包裝)。

宿主菌

由於 M13 噬菌體通過 F 質粒編碼的性纖毛進入宿主細胞內,故只能用雄性細菌來增殖病毒。 Messing 及其同事已經構建了許多攜帶 F' 質粒並便於 M13 載體進行基因操作的多種大腸桿菌菌株,其中最重要的遺傳標誌有:
(1) lacZ D Ml5 lacZ 基因缺失突變體
(2) D(lac-proABlac 基因缺失突變體。
(3) lacIq lacI 基因的突變體。
(4) proAB 細菌染色體脯氨酸生物合成酶類的編碼區域。
(5) traD36 抑制 F' 因子接合轉移的突變。
(6) hsdRl7 與 hsdR 4 對大腸桿菌 K 株 Ⅰ 類限制 - 修飾系統失去限制活性但仍保留修飾功能的突變體。
(7) recA1 大腸桿菌重組酶基因。
(8) supE 琥珀抑制基因
在 M13 噬菌體載體中進行克隆時常用的宿主菌株如下。
JM101 supE D (lac-proAB)[F'traD 36 proAB + lac I q lacZ D M15]
JM105 JM101/ hsdR 4
JM107 JM101/ hsdR 17
JM109 JM101/ hsdR 17 recA1
TG1 JM101/ hsd D5(不修飾不限制)
XL1-Blue supE lac- hsdR 17 recA1 [F' proAB + lac I q lacZ D M15]Tn 10 (Tet r)

最新發現

美國加州大學巴克利分校的科學家近日研發出利用病毒M13噬菌體發電的技術,未來可用於手機充電。
它具有壓電性,即在受到擠壓時能夠將機械能轉化為電能。研究人員把噬菌體平鋪在一層膜上,然後把幾層這樣的薄膜疊加在一起,在這些薄膜上加上電極,通過按壓薄膜就能產生微小的電流。
科學家稱,M13噬菌體是一種潛在的完美能源,因為這種病毒僅吞食細菌,對人體無害,綠色環保。此外,這種能源也很廉價,並且容易獲得,從一個盛放被感染細菌的燒瓶中就可以培養出上萬億個病毒。

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