多重連線探針擴增技術（multiplex ligation-dependent probe amplification ,MLPA）於2002年由Schouten等首先報導，是近幾年發展起來的一種針對待檢DNA序列進行定性和半定量分析的新技術。
基本介紹
- 中文名：多重連線探針擴增技術
- 外文名：multiplex ligation-dependent probe amplification
- 縮寫：MLPA
- 報導時間：2002年
基本信息,原理,套用,優缺點,
基本信息
多重連線探針擴增技術（multiplex ligation-dependent probe amplification ,MLPA）於2002年由Schouten等首先報導，是近幾年發展起來的一種針對待檢DNA序列進行定性和半定量分析的新技術。該技術高效、特異，在一次反應中可以檢測45個核苷酸序列拷貝數的改變，目前已經套用於多個領域、多種疾病的研究。
原理
MLPA的基本原理包括探針和靶序列DNA進行雜交，之後通過連線、PCR擴增，產物通過毛細管電泳分離及數據收集，分析軟體對收集的數據進行分析最後得出結論。每個MLPA探針包括兩個螢光標記的寡核苷酸片段，一個由化學合成，一個由M13噬菌體衍生法製備；每個探針都包括一段引物序列和一段特異性序列。在MLPA反應中，兩個寡核苷酸片段都與靶序列進行雜交，之後使用連線酶連線兩部分探針。連線反應高度特異，只有當兩個探針與靶序列完全雜交，即靶序列與探針特異性序列完全互補，連線酶才能將兩段探針連線成一條完整的核酸單鏈；反之，如果靶序列與探針序列不完全互補，即使只有一個鹼基的差別，就會導致雜交不完全，使連線反應無法進行。連線反應完成後，用一對通用引物擴增連線好的探針，每個探針的擴增產物的長度都是唯一的，範圍在130～480bp。最後，通過毛細管電泳分離擴增產物，Genemarker軟體分析，得出結論。只有當連線反應完成，才能進行隨後的PCR擴增並收集到相應探針的擴增峰，如果檢測的靶序列發生點突變或缺失、擴增突變，那么相應探針的擴增峰便會缺失、降低或增加，因此，根據擴增峰的改變就可判斷靶序列是否有拷貝數的異常或點突變存在。
套用
檢測染色體亞端粒的基因重排
智力低下是遍及全世界的嚴重危害兒童身心健康的一類疾患，其中一部分是由可知原因引起的，包括感染、中毒、腦疾病等，但是很大一部分患兒的病因不明。近幾年的研究發現，包括亞端粒在內的基因重排是引起智力低下的重要原因[M,N]，因為亞端粒的基因非常豐富，微小的改變就會累及眾多的基因，從而導致疾病的發生。目前，套用較多的檢測染色體亞端粒的方法包括染色體核型分析，螢光原位雜交（FISH），但是前者不能檢出亞端粒微小的基因重排，而後者費時、費力、又非常昂貴，不易推廣。MLPA-P036和MLPA-P070試劑盒，針對每一個染色體的末端都設計有一個特異性探針，它經濟、高效、快速，可以用於檢測亞端粒的基因重排[P,Q]，揭示部分智障患兒的發病原因。
檢測染色體的非整倍性改變[S,T]
目前，檢測染色體的非整倍性改變的方法主要為染色體核型分析，但是它在檢測羊水細胞、絨毛或是其他胎兒細胞時，需要進行體外細胞培養，若培養失敗、細胞過少或染色體形態較差時，常常影響實驗結果。套用MLPA檢測這類標本時，不需要體外培養，少量標本即可進行檢測，針對易發生非整倍性改變的染色體（13，18，21，X，Y）上的幾個熱點基因設計特異性探針，根據特定基因拷貝數的改變，即可確定染色體數目的異常。
檢測單核苷酸的多態性（SNP）和點突變
根據MLPA的原理可知，靶序列DNA只要有一個鹼基的改變，便可導致雜交不完全，使其擴增產物缺失，因此，MLPA高度特異性的檢測可用於多種SNP和點突變。
幾種常見的兒童遺傳性疾病的檢測
1）智力低下綜合徵
多種已知的智力低下綜合徵與染色體特定區域的基因改變相關。這些患兒臨床表現複雜，個體差異大，缺乏特徵性表現，醫生很難作出準確診斷。MLPA-P064試劑盒，針對特定的染色體區域設計了43個探針，可以明確幾種疾病的診斷[A]，包括：1p-缺失綜合徵，Williams綜合徵，Smith-Magenis綜合徵，Miller-Dieker綜合徵，Digeorge綜合徵[W]，Alagille綜合徵，Sotos綜合徵。根據同樣的原理，MLPA-P096試劑盒可檢測的疾病包括：Wolf-Hirschhorn綜合徵，Cri du Chat綜合徵，WAGR綜合徵，Downs綜合徵等。
2）X連鎖型智力低下[C]
X連鎖型智力低下可以分為綜合徵型和非綜合徵型，前者具備特徵性的臨床表現，而後者沒有特異性症狀，智力低下常常為患兒的唯一表現。目前已經發現19個基因與X連鎖型智力低下相關，MLPA-P106可以檢測其中14個相關基因的改變。
3）假肥大型肌營養不良症[D,E,F]
假肥大型肌營養不良症包括Duchenne型肌營養不良（DMD）和Becker型肌營養不良，臨床表現主要為骨盆帶肌和下肢近端肌肉無力，腓腸肌假性肥大等，致病基因位於Xp21.2，包括70多個外顯子。疾病的發生與DMD基因的缺失、重複或點突變相關。MLPA-P034和MLPA-P035試劑盒設計了80多個探針可以檢測每一個外顯子的缺失或重複突變，及部分點突變。
4）Prader-Willi綜合徵（PWS）和Angelman綜合徵（AS）[H,I]
PWS和AS都是由染色體15q11-13缺失或同源二倍體所致。如果是父源性染色體15q11-13缺失或母源性同源二倍體則引起PWS，如果是母源性染色體15q11-13缺失或父源性同源二倍體則引起AS。在人類，父源15q11-13區域存在非甲基化的SNRPN印跡基因，母源性15q11-13區域存在完全甲基化的SNRPN印跡基因。甲基化特異性的MLPA試劑盒ME028採用半定量式的方式可以檢測基因拷貝數的改變，探針所識別的DNA序列包括甲基化敏感的核酸內切酶HhaⅠ位點，因此可以分析CpG島的甲基化狀態，從而區別PWS和AS。
5）其他疾病的檢測
MLPA還可以用於成神經細胞瘤[J]、a-地中海貧血[K]等疾病的診斷。成神經細胞瘤是兒童中樞神經系統發生的腫瘤，明確特徵性基因的改變對確認神經腫瘤發生的過渡階段、治療和預後都有重要意義，為臨床提供極大的幫助。
優缺點
MLPA結合了DNA探針雜交和PCR技術，具有以下優點1、高效：一次反應可以檢測45個靶序列拷貝數的改變。2、特異：可以檢測點突變。3、快速：一次實驗可以在24小時內完成。4、簡便：不同的試劑盒操作基本相同，容易掌握。
MLPA雖然具有很大優點，但也有其局限性1、需要精確測量DNA的濃度，樣本容易被污染。2、不能用於單個細胞的檢測。3、MLPA用於檢測基因的缺失或重複，不適合檢測未知的點突變類型。4、不能檢測染色體的平衡易位。
總之，作為一種新的技術，隨著醫學與生物學的發展，MLPA會日益完善，其套用領域也會日益廣泛。
