基本介紹
- 中文名：蜂蜜酵母
- 外文名：Honey yeast
- 初篩：鏡檢、杜氏管發酵法
- 復篩：產酒精能力測試、耐性能力測試
- 屬：畢赤酵母屬
- 學科：食品工業學
蜂蜜酵母的篩選,酵母菌的初篩,酵母菌的復篩,蜂蜜酵母活性測定,發酵性能的測定,酵母菌發酵力測試,凝聚性測定,蜂蜜酒酵母菌的分子生物學鑑定,
蜂蜜酵母的篩選
酵母菌分離純化取自然發酵的蜂蜜發酵液1mL，梯度稀釋至10-7。選擇10^-3～10^-4稀釋度，取稀釋的50μL菌液塗布於麥芽汁培養基和沙氏培養基中，28℃培養48h，待長出菌落，挑選整齊的單個菌落，將單菌落劃線分離2～3次，直至菌落形態和菌體形態基本一致，經顯微鏡檢驗為純種後轉於麥芽汁瓊脂斜面，4℃保存。菌種用阿拉伯數字S1，S2，S3，S4…依次編號。
酵母菌的初篩
取10mL糖度為10°Brix的麥芽汁液體培養基，滅菌，冷卻後接種8%酵母菌，比較酵母菌在杜氏管中的產氣情況，篩選產氣量大，起酵時間在48h內的酵母菌株。記錄發酵時間和產氣情況，重複3次。活化條件：10°Brix麥芽汁液體培養基28℃震盪10h，接種量8%；發酵條件：13°Brix麥芽汁28℃靜止發酵48h。
酵母菌的復篩
高滲耐受性
採用杜氏發酵管法測定酵母菌耐高滲能力。將分離菌接種到40%烏桕蜜試管中，28℃培養24h。在660nm處測定OD值。試管連續培養，觀察泡沫產生情況。根據氣體產生的速度和產氣量，比較不同酵母菌株的耐高滲能力。
酒精耐受性
從實際生產而言，要想採用直接發酵法生產出酒精度較高，品味良好的蜂蜜酒，一般要將酵母菌直接置於25%～30%的蜜汁中培養。酵母發酵能力在很大程度上取決於它對酒精耐受力的大小。採用30%蜂蜜、20%酒精環境下篩選酵母菌。取已滅菌的試管數支，以無菌操作將酵母菌接入體積分數為20%乙醇和無菌麥芽汁培養基中，搖勻，28℃培養7d，然後在660nm處測OD值，同時觀察氣泡產生的情況。
pH耐受性
耐酸酵母是指在pH≤4的環境下，可以生長或代謝的酵母。採用pH4.0的環境培育篩選酵母菌。將分離菌接種到pH4.0的麥芽汁液體培養基中，培養24h，在660nm處測OD值，觀察氣泡產生情況。
SO2耐受性
採用添加200mg/LNaHSO3的方法，比較OD值和產氣時間。將酵母菌接入含200mg/LNaHSO3的麥芽汁培養基中，在相同條件下培養，於660nm處測OD值。同時觀察杜氏管中的氣泡產生情況（產氣時間和產氣量），篩選所需釀造菌株。
蜂蜜酵母活性測定
發酵性能的測定
將蜜起始糖度調整為25%，75℃滅菌30min，冷到28℃左右，加入0.15%阿米諾酶，分別接入5種活化的優良菌種（S2、S11、S21、S33、S37）和0.2%葡萄酒活性乾酵母（CK），28℃，發酵7d，測定蜂蜜酒的酒精度、殘糖、酸度和總酯等理化指標。
酒精度的測定：密度瓶法；pH值的測定：採用pH計法；總糖的測定：手持測糖儀；酸度的測定：滴定中和法；總酯的測定：蒸餾皂化法。
酵母菌發酵力測試
採用CO2失重法，將活化好的優選酵母菌液和CK菌液接入已滅菌的麥芽汁培養基中，接種完畢，稱重發酵瓶，28℃培養，連續發酵12d，然後每天稱重1次。稱重前先搖晃瓶子，除去二氧化碳。以產生CO2的量（發酵瓶失重）為縱坐標，發酵時間為橫坐標，繪製發酵速率曲線。
凝聚性測定
將活化好的菌株和CK分別接種於麥芽汁液體培養基中，28℃培養5d。取培養液置離心管中，3500r/min離心15min，收集酵母細胞。用無菌水洗滌2～3次，取酵母泥1g，放入15mL離心管中，加入10mLpH4.5的醋酸緩衝溶液，搖勻，使其成懸浮狀態，20℃水浴中靜置20min。將此懸浮液連續搖動5min，讓酵母重新懸浮，再靜置，記錄10min時沉澱酵母的容積，即酵母細胞沉澱的體積，本斯值。凝聚性強弱依據本斯值來確定。
蜂蜜酒酵母菌的分子生物學鑑定
為進一步確定優良酵母的種屬地位，從酵母菌初篩、復篩的實驗結果中挑選1株代謝旺盛的供試酵母菌，用無菌水洗滌。用酵母基因組DNA試劑盒提取酵母的DNA。以擴增酵母菌26SrD-NA序列的通用引物設計PCR擴增引物，上游引物5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’，下游引物5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’。
PCR反應體系25μL，其中10×PCRBuffer2.5μL，dNTP2.0μL，10μmol/L上、下游引物各0.5μL，酵母基因組DNA1.0μL，TagDNA聚合酶0.5μL，其餘為ddH2O。反應條件：94℃變性3min；94℃變性50s，55℃復性50s，72℃延伸1.5min，共30個循環；72℃延伸10min。擴增產物與PGEMeasy-T載體連線，陽性克隆經酶切鑑定後測序。所得序列用Blast軟體與GeneBank中的其它酵母菌26SrDNA序列進行比對，找出與其相似性最高的序列及酵母菌種類，用MEGA4.0軟體採用鄰近法（Neighbor-Jointing）進行系統進化樹的構建與分析。
