肉毒梭菌檢測

肉毒梭菌檢測是指肉毒梭狀芽孢桿菌的檢測。

肉毒梭菌屬革蘭氏陽性厭氧菌，廣泛分布於自然界中。肉毒梭菌代謝產生的肉毒神經毒素能夠抑制神經末梢乙醯膽鹼的分泌，導致運動神經和延腦麻痹，根據其抗原性分為A～G 型7 個型，其中與人類中毒有關的是A、B、E、F 型，我國報告由肉毒毒素致病的大多為A 型毒素。

目前,ELISA 技術已經廣泛套用於食品和臨床樣本中毒素的檢測。相比較肽鏈內切酶ELISA 的免疫學檢測方法的優越性大些，不僅可以檢測有活性的毒素，而且特異性強，直接檢測毒素作用的底物蛋白，內切酶活性檢測方法的靈敏度通常和時間相關，時間延長可以獲得更高的靈敏度.

基本介紹

• 中文名：肉毒梭菌檢測
• 外文名：detection of Clostridium botulinum
• 全稱：肉毒梭狀芽孢桿菌的檢測

肉毒桿菌是一種生長在缺氧環境下的致病菌，全稱肉毒梭狀桿菌，在罐頭食品及密封醃漬食物中具有極強的生存能力，它在繁殖過程中所分泌的肉毒毒素具有極強的毒性，是KCN毒性的一萬倍。純化結晶的肉毒毒素1mg能殺死2億隻小鼠，對人的致死劑量約0.1μg。它通過阻斷人體神經接頭，導致全身麻痹、癱瘓，嚴重時能引起人呼吸肌麻痹，導致無法呼吸，最終死亡。目前報導紐西蘭恆天然濃縮乳清蛋白粉大批量被肉毒桿菌污染，多家產品被捲入其中，科標化工分析檢測中心為了我國奶粉質量安全，現開展食品中肉毒桿菌檢測。
科標化工分析檢測中心可依照ISO、ASTM、DIN、GB、SN等標準完成食品、微生物、飼料、藥品、紡織品、農業、高分子材料、生物產品、建築材料以及微生物產品理化性能、力學性能、電氣性能等測試。中心通過了中國國家認證認可監督管理委員會和中國合格評定國家認可委員會的二合一（CMA、CNAS）實驗室認證認可，能出具權威的第三方檢測報告。

食品中肉毒桿菌檢測(PCR檢測方法)

一、實驗原理

科標化工分析檢測中心結合國標GB/T4789.12-2003食品中衛生微生物學檢驗肉毒桿菌及內毒素檢驗和SN/T2525-2010食品中肉毒桿菌的PCR檢測方法對食品中肉毒桿菌進行檢驗。
將樣品經增菌後劃平板分離單菌落，挑取可疑菌落到胰蛋白腖葡萄糖酵母浸膏肉湯(TPGY)培養基培養，對培養物用DNA提取試劑盒抽提DNA，進行PCR擴增，用瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR產物中是否含有肉毒桿菌的的特徵條帶，從而對食品中是否污染肉毒桿菌進行快速檢測。

二、試驗方法

1、樣品的增菌培養
2、培養物分離
3、DNA提取、擴增

四、結果判定

陰性對照和空白對照均未出現條帶，陽性對照出現預期大小的擴增條帶，待測樣品出現預期大小的擴增條帶則判定為PCR結果陽性，科標化工分析檢測中心報告“檢出某型（A,B,E,F）肉毒桿菌”。待測樣品未出現預期大小的擴增條帶則判定為PCR結果為陰性，科標化工分析檢測中心報告“未檢出某型（A,B,E,F）肉毒桿菌”。

附圖

1、PCR擴增儀

PCR擴增儀

2、凝膠成像系統

凝膠成像系統

3、厭氧培養箱

厭氧培養箱

4、PCR擴增圖譜

PCR擴增圖譜

肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗

1 主題內容與適用範圍

本標準規定了肉毒梭菌及肉毒毒素的檢驗方法。
本標準適用於食品和食物中毒樣品中肉毒梭菌及肉毒毒素的檢驗。

2 引用標準

GB4789.28　食品衛生微生物學檢驗染色法、培養基和試劑

3 檢驗程式

肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗程式如下：
註：①報告(一)：檢樣含有某型肉毒毒素。
②報告(二)：檢樣含有某型肉毒梭菌。
③報告(三)：由樣品分離的菌株為某型肉毒梭菌。
如上所示，檢樣經均質處理後，及時接種培養，進行增菌、產毒，同時進行毒素檢測試驗。毒素檢測試驗結果可證明檢樣中有無肉毒毒素以及有何型肉毒毒素存在。
對增菌產毒培養物，一方面做一般的生長特性觀察，同時檢測肉毒毒素的產生情況。所得結果可證明檢樣中有無肉毒梭菌以及有何型肉毒梭菌存在。
為其他特殊目的而欲獲純菌株，可用增菌產毒培養物進行分離培養，對所得純菌株進行形態、培養特性等觀察及毒素檢測，其結果可證明所得純菌為何型肉毒梭菌。

6操作步驟

6.1　肉毒毒素檢測
6.1.1　檢出試驗
6.1.2　確證試驗
6.1.3　毒力測定
6.1.4　定型試驗
註：①未經胰酶激活處理的檢樣的毒素檢出試驗或確證試驗若為陽性結果，則胰酶激活處理液可省略毒力測定及定型試驗。
②為爭取時間儘快得出結果，毒素檢測的各項試驗也可同時進行。
②根據具體條件和可能性，定型試驗可酌情先省略C、D、F及G型。
④進行確證及定型等中和試驗時，檢樣的稀釋應參照所用肉毒診斷血清的效價。
⑤試驗動物的觀察可按陽性結果的出現隨時結束，以縮短觀察時間；唯有出現陰性結果時，應保留充分的觀察時間。
6.2　肉毒梭菌檢出(增菌產毒培養試驗)
6.3　分離培養
6.3.1　毒素檢測：試驗方法同4.1。
6.3.2　培養特性檢查
註：為檢出蜂蜜中存在的肉毒梭菌，蜂蜜檢樣需預溫37℃(流質蜂蜜)，或52～53℃(晶質蜂蜜)，充分攪拌後立即稱取20g，溶於100mL滅菌蒸餾水(37℃或52～53℃)，攪拌稀釋，以8000～10000r/min離心30min(20℃)，沉澱，加滅菌蒸餾水1mL，充分搖勻，等分各半，接種庖肉培養基(8～10mL)各1支，分別在30℃及37℃下厭?跖嘌?d，按6.2進行肉毒毒素檢測。

檢測研究進展

一、生理生化檢測技術

1、動物實驗法

2、細菌培養法

3、孢子培養法

二、免疫學檢測技術

1、膠體金免疫層析法

2、乳膠凝集法

3、酶免疫法

4、電化學發光免疫法

三、分子生物學檢測技術

1、聚合酶鏈式反應( PCR)

2、螢光定量PCR

3、環介導等溫核酸擴增法

4、PCR－DHPLC

肉毒中毒的預防

肉毒中毒的預防，主要是加強食品的衛生管理監督。對病人應儘早根據症狀作出診斷，迅速注射A、B、E三型多價抗毒素。若毒素型別已定，可注射相應的抗毒索；直至症狀消失。同時要加強護理，對症治療，特別注意預防呼吸肌的麻痹和窒息，控制呼吸道的繼發感染。嬰兒肉毒病的治療是幫助通氣呼吸，及維持營養等支持療法，抗生素和抗毒素不但無效，可能還有害。因為使用了抗生素後，腸內大量的肉毒桿菌突然死亡，毒素釋放被短期內大量吸收後會加重病情。