時間分辨螢光免疫分析

時間分辨螢光免疫測定（TRFIA）是一種非同位素免疫分析技術，它用鑭系元素標記抗原或抗體，根據鑭系元素螯合物的發光特點，用時間分辨技術測量螢光，同時檢測波長和時間兩個參數進行信號分辨，可有效地排除非特異螢光的干擾，極大地提高了分析靈敏度。

分析原理

在生物流體和血清中的許多複合物和蛋白本身就可以發螢光，因此使用傳統的發色團進而進行螢光檢測的靈敏度就會嚴重下降。大部分背景螢光信號是短時存在的，因此將長衰減壽命的標記物與時間分辨螢光技術相結合，就可以使瞬時螢光干擾減到最小化。

時間分辨螢光分析法（TRFIA）實際上是在螢光分析（FIA）的基礎上發展起來的，它是一種特殊的螢光分析。螢光分析利用了螢光的波長與其激發波長的巨大差異克服了普通紫外-可見分光分析法中雜色光的影響，同時，螢光分析與普通分光不同，光電接受器與激發光不在同一直線上，激發光不能直接到達光電接受器，從而大幅度地提高了光學分析的靈敏度。但是，當進行超微量分析的時候，激發光的雜散光的影響就顯得嚴重了。因此，解決激發光的雜散光的影響成了提高靈敏度的瓶頸。

解決雜散光影響的最好方法當然是測量時沒有激發光的存在。但普通的螢光標誌物螢光壽命非常短，激發光消失，螢光也消失。不過有非常少的稀土金屬（Eu、Tb、Sm、Dy）的螢光壽命較長，可達1～2ms，能夠滿足測量要求，因此而產生了時間分辨螢光分析法，即使用長效螢光標記物，在關閉激發光後再測定螢光強度的分析方法。

平時常用的稀土金屬主要是Eu（銪）和Tb（鋱），Eu螢光壽命1ms，在水中不穩定，但加入增強劑後可以克服；Tb螢光壽命1.6ms，水中穩定，但其螢光波長短、散射嚴重、能量大易使組分分解，因此從測量方法學上看Tb很好，但不適合用於生物分析，故Eu最為常用。

信號原理

普通物質螢光光譜分為激發光譜和發射光譜，在選擇螢光物質作為標記物時，必須考慮激發光譜和發射光譜之間的波長差，即Stokes位移的大小。如果Stokes位移小，激發光譜和發射光譜常有重疊，相互干擾，影響檢測結果的準確性。鑭系元素的螢光光譜有較大的Stokes位移，最大可達290nm，激發光譜和發射光譜間不會相互重疊，加上其發射的光譜信號峰很窄，螢光壽命長，銪的螢光壽命可達730us，檢測中只要在每個激發光脈衝過後採用延緩測量時間的方式，待短壽命的背景螢光衰變消失後，再打開取樣門儀器記錄長壽命銪鰲合物發射的特異性螢光，可以避免本底螢光干擾，提高檢測的精密度。

TRFIA的測量儀器是時間分辨螢光計，由三大部分組成：光源：脈衝光源：氙燈（每秒閃爍1000次）；小型N2雷射器；輸出脈衝波長：337nm螢光信號獲取系統；數據處理系統醫學教|育網蒐集整理。

增強原理

解離增強鑭系元素螢光免疫分析（DELFIA）是時間分辨螢光免疫分析中的一種。它用具有雙功能基團結構的螯合劑，使其一端與銪（Eu）連線，另一端與抗體/抗原分子上的自由氨基連線，形成EU標記的抗體/抗原，經過免疫反應之後生成免疫複合物。由於這種複合物在水中的螢光強度非常弱，因此加入一種增強劑，使Eu從複合物上解離下來，自由Eu同增強劑中的另一種螫合劑螯合形成一種膠態分子團，這種分子團在紫外光的激發下能發出很強的螢光，信號增強了百萬倍。因為這種分析方法使用了解離增強步驟，因此稱為解離增強鑭系元素螢光免疫分析。這是目前在時間分辨螢光免疫分析中套用最多的一種分析系統。

套用

1.激素：甲狀腺激素、甾體類激素。

2.病毒性肝炎標誌物。

3.腫瘤相關抗原、胃蛋白酶原（PG）醫學教|育網蒐集整理。

4.藥物。

5.多肽類。