抑菌試驗

用於測定抗菌藥物體外抑制細菌生長效力的試驗稱為抑菌試驗。通過抑菌實驗，可以測定一個藥物的最低抑菌濃度，用以評價該藥物的抑菌性能，這是抗菌藥物的最基本的藥效學數據。主要方法有進行定性測定的擴散法（如抑菌斑試驗）和進行定量測定的稀釋法（如最低抑菌濃度實驗）。

基本介紹

• 中文名：抑菌試驗
• 目的：測抗菌藥物體外抑制細菌生長效力
• 方法：定性測定的擴散法等
• 相關：臨床微生物

常用方法

常量肉湯稀釋法

A、抗菌藥物貯存液製備

1.1.1.抗菌藥物貯存液製備 抗菌藥物貯存液濃度不應低於1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍於最高測定濃度。溶解度低的抗菌藥物可稍低於上述濃度。抗菌藥物直接購自廠商或相關機構。所需抗菌藥物溶液量或粉劑量可公式進行計算。例如：需配製100 ml濃度為1280μg/ml的抗生素貯存液，所用抗生素為粉劑，其藥物的有效力為750μg/mg。用分析天平精確稱取抗生素粉劑的量為182.6 mg。根據公式計算所需稀釋劑用量為：（182.6 mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然後將182.6 mg抗生素粉劑溶解於107.0ml稀釋劑中。製備抗菌藥物貯存液所用的溶劑和稀釋劑見表5。配製好的抗菌藥物貯存液應貯存於-60℃以下環境，保存期不超過6個月。

B、藥敏試驗用抗菌藥物濃度範圍

1.1.2.藥敏試驗用抗菌藥物濃度範圍 根據NCCLS抗菌藥物敏感性試驗操作標準，藥物濃度範圍應包含耐藥、中介和敏感分界點值，特殊情況例外。

C、培養基

1.1.3. 培養基 NCCLS推薦使用Mueller-Hinton（MH）肉湯，pH7.2~7.4。需氧菌及兼性厭氧菌在此培養基中生長良好。在測試葡萄球菌對苯唑西林的敏感性時，應在肉湯中加入2%（W/V）氯化鈉，按製造廠家的要求配製需要量的MH肉湯。嗜血桿菌屬菌使用HTM肉湯，肺炎鏈球菌和其它鏈球菌使用含2%~5%溶解馬血的MH肉湯。

D、接種物的製備

1.1.4.接種物的製備 有2種方法配製接種物，一是細菌生長方法，用接種環挑取形態相似待檢菌落3-5個，接種於4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉湯中，35℃孵育2-6h。增菌後的對數生長期菌液用生理鹽水或MH肉湯校正濃度至0.5麥氏比濁標準，約含1~2×108CFU/ml。二是直接菌落懸液配製法，對某些苛養菌，如流感嗜血桿菌、淋病奈瑟菌和鏈球菌及甲氧西林耐藥的葡萄球菌等菌株，推薦直接取培養18~24h的菌落調配成0.5麥氏比濁標準的菌懸液。用MH肉湯將上述菌懸液進行1∶100稀釋後備用。注意應在15分鐘內接種完配製好的接種物，並取一份接種物在非選擇性瓊脂平板上傳代培養，以檢查接種物純度。

註：在臨床微生物學檢驗中，麥氏比濁法常用於細菌鑑定、藥敏實驗前配置菌液時大致判斷菌液濃度的一種方法，通常認為，如將配菌液濃度配成0.5麥氏比濁管時，相當於1.5×108細菌數/ml，由於方法本身就是一種估計的方法，所以儘管不同細菌大小差異很大，除了真菌孢子，細菌的差別不大，結果不會有影響。但是，標準比濁管的濃度，是藥敏實驗結果的影響因素之一。

E、附：0.5麥氏比濁管配製方法

0.048M BaCL2 (1.17% W/V BaCL2 . 2H2O) 0.5ml

0.36N H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml

將二液混合，置螺口試管中，放室溫暗處保存。用前混勻。

有效期為6個月。

F、稀釋抗菌藥物的製備及菌液接種

1.1.5.稀釋抗菌藥物的製備及菌液接種 取無菌試管（13×100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉湯外，其餘每管加入MH肉湯1ml，在第1管加入抗菌藥物原液（如1280μg/ml） 0.4ml混勻，然後吸取1ml至第2管，混勻後再吸取1ml至第3管，如此連續倍比稀釋至第11管，並從第11管中吸取1ml棄去，第12管為不含藥物的生長對照。此時各管藥物濃度依次為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然後在每管內加入上述製備好的接種物各1ml，使每管最終菌液濃度約為5×105CFU/ml。第1管至第11管藥物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125μg/ml。

G、孵育

1.1.6.孵育 將接種好的稀釋管塞好塞子，置35℃普通空氣孵箱中孵育16~20h；嗜血桿菌和鏈球菌在普通空氣孵箱中孵育20~24h；對可能的耐甲氧西林葡萄球菌和耐萬古黴素腸球菌應持續孵育滿24h。

H、結果判斷與解釋

1.1.7.結果判斷與解釋 在讀取和報告所測試菌株的MIC前，應檢查生長對照管的細菌生長情況是否良好，同時還應檢查接種物的傳代培養情況以確定其是否污染，質控菌株的MIC值是否處於質控範圍。以肉眼觀察，藥物最低濃度管無細菌生長者，即為受試菌的MIC。甲氧苄胺嘧啶或磺胺藥物的肉湯稀釋法終點判斷，與陽性生長對照管比較抑制80%細菌生長管藥物濃度為受試菌MIC。

根據NCCLS推薦的分界點值標準，判斷耐藥（resistant, R）、敏感(susceptible, S)或中介（intermediate, I）。S表示被測菌株所引起的感染可以用該抗菌藥物的常用劑量治療有效，禁忌症除外。R指該菌不能被抗菌藥物的常用劑量在組織液內或血液中所達到的濃度所抑制，或屬於具有特定耐藥機理（如β-內醯胺酶），所以臨床治療效果不佳。I是指MIC接近藥物的血液或組織液濃度，療效低于敏感菌。還表示被測菌株可以通過提高劑量（如β-內醯胺類藥物）被抑制，或在藥物生理性濃集的部位（如尿液）被抑制。另外，中介還作為“緩衝域”，以防止由微小的技術因素失控，所導致較大的錯誤解釋。

微量肉湯稀釋法

A、抗菌藥物和培養基製備

1.2.1.抗菌藥物和培養基製備 同常量肉湯稀釋法。

B、MIC板製備

1.2.2.MIC板製備 無菌操作，將倍比稀釋後不同濃度的抗菌藥物溶液分別加到滅菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加藥液，每孔10μl，第12孔不加藥作為生長對照，冰凍乾燥後密封，-20℃以下保存備用。

C、接種物製備

1.2.3.接種物製備 將用生長法或直接菌懸液法製備的濃度相當於0.5麥氏比濁標準的菌懸液，經MH肉湯1∶1000稀釋後，向每孔中加100μl，密封后置35℃普通空氣孵箱中，孵育16~20h判斷結果。當試驗嗜血桿菌屬，鏈球菌屬時，孵育時間為20~24h，試驗葡萄球菌和腸球菌對苯唑西林和萬古黴素的藥敏試驗時孵育時間必須滿24h。此時，第1孔至第11孔藥物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。

D、結果判斷

1.2.4.結果判斷 以在小孔內完全抑制細菌生長的最低藥物濃度為MIC。當陽性對照孔（即不含抗生素）內細菌明顯生長試驗才有意義。當在微量肉湯稀釋法出現單一的跳孔時，應記錄抑制細菌生長的最高藥物濃度。如出現多處跳孔，則不應報告結果，需重複試驗。通常對革蘭陰性桿菌而言，微量肉湯稀釋法測得的MIC與常量肉湯稀釋法測得的結果相同或低一個稀釋度（1孔或2倍）。

瓊脂稀釋法

A、介紹

瓊脂稀釋法是將不同劑量的抗菌藥物，加入融化並冷至50℃左右的定量MH瓊脂中，製成含不同遞減濃度抗菌藥物的平板，接種受試菌，孵育後觀察細菌生長情況，以抑制細菌生長的瓊脂平板所含最低藥物濃度為MIC。本法優點是可在一個平板上同時作多株菌MIC測定，結果可靠，易發現污染菌；缺點是製備含藥瓊脂平板費時費力。

B、培養基製備

2.1.培養基製備 使用MH瓊脂，按商品說明書進行配製，pH7.2~7.4。淋病奈瑟菌使用GC瓊脂基礎加1%添加劑；其它鏈球菌使用含5%（V/V）綿羊血的MH瓊脂（當試驗磺胺藥時，使用溶解的馬血）。

C、含藥瓊脂平板製備

2.2.含藥瓊脂平板製備 根據實驗設計，將已倍比稀釋的不同濃度的抗菌藥物分別加入已加熱溶解，並在45~50℃水浴中平衡的MH瓊脂中，充分混勻傾倒滅菌平皿，瓊脂厚度3~4mm。通常按1∶9比例配製藥物瓊脂平板，根據需要來選擇藥物濃度範圍。配製好的含藥瓊脂平板應裝入密封塑膠袋中，置2~8℃冰櫃可貯存5天。

D、接種物製備與接種

2.3.接種物製備與接種 製備濃度相當於0.5麥氏標準比濁管的菌懸液，再1∶10稀釋，以多點接種器吸取製備好菌液（約1~2μl）接種於瓊脂平板表面，每點菌數約為104CFU，形成直徑為5~8mm的菌斑。接種好後置35℃孵育16~20h（甲氧西林耐藥葡萄球菌、萬古黴素耐藥腸球菌孵育時間應滿24h），觀察結果。奈瑟菌屬、鏈球菌屬細菌置5%二氧化碳、幽門螺桿菌置微需氧環境中孵育。

E、結果判斷

2.4.結果判斷 將平板置於暗色、無反光物體表面上判斷試驗終點，以抑制細菌生長的最低藥物濃度為MIC。在含甲氧苄胺嘧啶或磺胺瓊脂平板上可見輕微細菌生長，與生長對照比較抑制80%以上細菌生長的最低藥物濃度作為終點濃度。

如果出現有2個以上菌落生長於含藥濃度高於終點水平的瓊脂平板上，或低濃度藥物瓊脂平板上不長而高濃度藥物瓊脂平板上生長現象，則應檢查培養物純度或重複試驗。

紙片擴散法

紙片擴散法(K-B法)又稱瓊脂擴散法

K-B法藥敏試驗時接種物配製有兩種方法。

第一種是肉湯增菌法（對數生長法），是用接環挑取3-5個細菌菌落入肉湯增菌管中進行增菌4-6小時，然後用生理鹽水或肉湯對增菌管中的培養物進行稀釋校正使其濃度達到0.5麥氏比濁標準（因為經過增菌培養其培養物濃度一般都高於此標準）。

第二種方法是直接菌落法：從孵育18-24小時的非選擇性培養基上，挑取3-5菌落，直接用肉湯或鹽製成懸液作為接種，然後將濁度調整至0.5麥氏比濁標準。此法是檢測苛養菌（如嗜血桿菌、淋病奈瑟菌和鏈球菌）和潛在的對甲氧西林耐藥的葡萄球菌的推薦方法。

將菌製成菌懸液用無菌棉簽蘸取菌液在管壁上擠去多餘菌液 ,塗布整個M2H平板表面 ,反覆 3 次 ,每次將平板旋轉60 度 ,保證塗布均勻 ,35 ℃培養後菌落呈半融合狀態 ,否則影響藥敏結果。

K-B 法指定用 M-H瓊脂平板 ,套用直徑90cm平皿 ,在水平的無菌台上傾倒 ,準確量取高壓滅菌後的M2H瓊脂液25ml ,使之瓊脂板厚度為 4mm。否則厚度過高 ,使含藥物紙片的藥物半球形擴散的體積加大 ,導致假耐藥;反之導致假敏感。

要求紙片直徑 6.00～6.35mm每片吸水量約012 μl ,紙片的藥物含量必須與 K 2B 法規定的

一致 ,用前必須做質量鑑定 ,質量合格方可使用。紙片的保存尤為重要 ,一般要求保存在有乾燥劑的容器內低溫保存 ,紙片取出後須放室溫10min後方可打開 ,否則空氣中的水份冷凝在紙片上易潮解 ,使藥物失效影響藥敏試驗結果。

E試驗

E試驗是指濃度梯度瓊脂擴散試驗，其原理基本同擴散法，即濃度呈連續梯度的抗菌藥物從塑膠試條中向瓊脂中擴散，在試條周圍抑菌濃度範圍內受試菌的生長被抑制，從而形成透明的抑菌圈。E試驗綜合了稀釋法和擴散法的原理和特點，同時還彌補了二者的一些不足，可以像稀釋法一樣直接定量測出抗菌藥物對受試菌的MIC。

A、培養基、菌液製備和接種

3.1.培養基、菌液製備和接種 同紙片擴散法。

B、貼E試驗條

3.2.貼E試驗條 同紙片擴散法，E試驗條的刻度面朝上，不得貼反，一旦接觸瓊脂後不得再移動。直徑150mm的平皿內可放置6根E試驗試條，90mm者一般只能放置1根。

C、孵育時間和溫度

3.3.孵育時間和溫度 同紙片擴散法。

D、結果閱讀

3.4.結果閱讀 孵育後圍繞試條可形成一個橢圓形的抑菌圈，在抑菌圈和試條的橫切相交處試條上的讀數刻度即是測定抗菌藥物對受試菌的MIC。閱讀時應注意的問題見供應商的產品說明書。