最小抑菌濃度

濃度測定

(1)掌握細菌培養技術，包括細菌的分離、培養，含菌量的測定。

(2)掌握細菌分離培養過程中的無菌操作。

(3)掌握微量肉湯二倍稀釋法測定抗菌藥物MIC的基本步驟。能準確測出各種抗菌藥物的MIC值，了解單藥的抗菌活性。

(4)為棋盤法設計棋盤做準備，求取棋盤法的中心濃度。

抗生素在體外體系內能夠對細菌的生長起到一定的抑制生長的作用。

1、菌株：標準菌株或臨床分離菌株。

2、藥物及培養基：兩種抗菌藥(註明來源及含量)、MH肉湯培養基和LB營養瓊脂等。

3、器材：96孔細胞培養板、1ml和200μL移液槍、1ml和200μL槍頭、10ml刻度吸管、洗耳球、小試管、錐形瓶、容量瓶、小藥瓶加塞、試管架、平皿、接種棒、酒精燈、分析天平、自動高壓滅菌鍋、超淨工作檯和37℃恆溫箱等。

1、實驗前的準備

(1)器具的清洗：將試管、平皿、錐形瓶、槍頭等實驗器具洗淨、包好，121℃、20min高壓滅菌，放烘箱烘乾備用。

96孔細胞培養板(不可高壓滅菌)用洗液浸泡、超聲、沖洗乾淨後，泡75%酒精備用(用前取出放超淨台吹乾，紫外殺菌2h以上)。

(2)試劑的配製：

①磷酸緩衝液(PBS)的配製：見圖1。

②生理鹽水的配製：稱取0.9g NaCI於錐形瓶中，加入100ml蒸餾水，溶解。

③MH瓊脂、肉湯的配製：按照實際說明書的要求，稱取一定量LB瓊脂於錐形瓶中，加入100ml蒸餾水，溶解。按照試劑說明書的要求，稱取一定量MH肉湯粉於錐形瓶中，加入100ml蒸餾水，溶解。取瓊脂和肉湯分裝於小試管中，每管2ml。

將配好的瓊脂、肉湯包裝好，121℃、20min高壓滅菌。待瓊脂稍冷後，在超淨台倒平板(15～20ml瓊脂平板)，凝固後置37℃恆溫培養箱過夜做無菌檢查，合格後和肉湯一起置於4℃冰櫃保存備用。

(3)藥物原液的配置及保存：各種抗菌藥用蒸餾水或不同pH的PBS稀釋至所需濃度，抗生素過濾除菌，化學合成藥高壓滅菌。分裝備用(圖2)。

(4)菌液的配製：挑取標準菌株或臨床分離菌株，放入MH營養肉湯，37℃培養16～24h，第二天在LB營養瓊脂平板上劃線培養16～24h，第三天挑單個菌落接種於2ml MH營養肉湯中，溫箱培養16～24h，製得供試菌液。

(1)用生理鹽水將上述菌液做10倍梯度稀釋(0.5ml菌液+4.5ml生理鹽水)。

(2)取10^-5、10^-6、10^-7三個滴度的菌液各0.1ml滴在瓊脂平板中央，輕輕拍打，使其均勻攤開，不要接觸平皿邊緣，每個梯度做2個平板，放入37℃溫箱培養16～24h。