基本介紹
- 中文名：固定劑
- 套用：光學顯微技術
- 危害：都有毒性
- 條件：通風櫥中
使用注意,種類,固定劑配方,
使用注意
固定劑種類
四氧化鋨（Osmium tetroxide）
四氧化鋨是一種很強的氧化劑，呈淺黃色結晶，分子量254，飽和水溶液的濃度為7.24%，它的水溶液為中性，有極大毒性。市售有密封的四氧化鋨晶體和四氧化鋨水溶液兩種。四氧化鋨晶體溶於水的速度很慢，必要時可以使用超音波設備來加速溶解。市面上也有已經配製好的2%四氧化鋨水溶液出售，使用相當方便。但要特別注意的是無論是四氧化鋨晶體還是水溶液都會揮發出四氧化鋨氣體，因此應將四氧化鋨置於密閉容器（玻璃容器）中保存。四氧化鋨氣體對呼吸系統有刺激，對眼睛有嚴重的破壞作用，因此在使用時應特別小心，儘可能在通風櫥中進行，並且嚴格控制用量。廢棄的四氧化鋨溶液應加入酒精水溶液或硫酸亞鐵溶液，使四氧化鋨轉化為黑色沉澱，以降低毒性方便收集處理。 四氧化鋨作為固定劑有如下優點：
2.能增加膜的反差，起到"電子染色"作用。用四氧化鋨固定的材料，往往細胞膜結構比較清晰。這是由於被還原的鋨沉積在細胞膜結構上，而鋨是一種原子序數較高的元素，能加強它們的電子散射（質量密度大），所以四氧化鋨作為固定劑的同時，又可作為電子染料，使被固定的樣品圖像有較好的反差。
四氧化鋨雖然具有以上優點，但它也存在不少缺點：
固定劑
固定劑固定的時間不宜太長。時間過長，會使組織變脆，給切片帶來困難。此外四氧化鋨與蛋白質、不飽和脂肪酸交聯形成的複合體都是易溶於水的物質，特別是在長時間的固定後，更易溶解。因此，使用四氧化鋨固定樣品，時間控制在12小時較為適宜。
甲醛（formaldehyde）
甲醛分子中只有一個碳原子，含有一個醛基，分子式為$CH_2O$，分子量為30。市面上雖然有多種形式的甲醛溶液出售，但它們含有少量的甲酸和甲醇，對被固定的樣品產生不良影響，適合電鏡固定使用的只有通過由多聚甲醛(paraformaldehyde)新鮮製備的甲醛溶液。甲醛溶液的毒性很大，即使是稀釋液也要格外小心操作。甲醛溶液對皮膚有硬化作用，長時間接觸可能導致皮膚破裂、皮炎或是過敏症狀；甲醛極易揮發，它對呼吸道也有影響，長時間暴露在甲醛氣體中會使嗅覺敏感度降低；此外甲醛對眼睛也有影響，而且還被認為是致癌物質。因此在操作甲醛粉末或溶液時都必須很小心，帶上手套並在通風櫥中進行。少量廢棄的醛類試劑（甲醛、戊二醛和丙烯醛等）可以直接在大量流水沖稀的情況下倒進水池內（但要注意有關部門的有關規定），當然少量的醛類試劑與過量的1M甘氨酸混合後，再在大量流水沖稀的情況下倒進水池，會更安全。通常100ml的甲醛(1%)需要50ml的1M甘氨酸，100ml1%戊二醛則需要35ml，而丙烯醛需要40ml。大量的醛類試劑必須集中回收處理。
固定劑
固定劑甲醛作為固定劑有如下特點：
由於甲醛的分子量小，它的穿透能力比戊二醛強，反應溫和，可用於細胞組織化學研究的前固定。而且它不象戊二醛有兩個醛基，引入較少的游離醛基到組織細胞中，因而在一些細胞組織化學研究中更有利。但它的反應是部分可逆的，對細胞基質保存差，脫水後大部分基質丟失，所以不少實驗室不單獨使用甲醛來固定樣品，而將它與戊二醛配製成混合固定液使用。
戊二醛（glutaraldehyde）
戊二醛是一種五碳醛，含有兩個醛基。分子式為$C_5H_8O_2$，分子量為100。電鏡固定通常用市售的25%的戊二醛水溶液稀釋成需要的濃度。其pH為4.0$\sim$5.0。氧氣、高溫、中性或鹼性pH均能使戊二醛發生聚合失去醛基，並降低交聯效力，所以平時這種原液應保存在低溫處。此外戊二醛存放時間過長時，pH值會降低，顏色變黃，固定效力也大大降低，若戊二醛pH值降至3.5以下或含有其它雜質時，必須純化後才能使用。戊二醛對皮膚有硬化作用，但它的揮發性較甲醛弱，最好能在通風櫥中操作。
固定劑
固定劑戊二醛作為固定劑有如下特點：
它的反應速度快，是優良的前固定劑。但它的滲透速度較慢，必要時配合甲醛使用效果更佳。
由於戊二醛有兩個醛基，它可以通過與相鄰的另一氨基反應，而產生交聯作用。戊二醛的兩個醛基也可能與同一氨基作用，形成環狀結構
這種環狀結構可以進一步與另一戊二醛反應，生成丁間醇醛冷凝物(Aldol condensate)。這種化合物與氧分子共同作用，生成穩定的嘧啶類衍生物(Pyridine derivatives)，並在此過程中發生交聯。
與甲醛不同，戊二醛的這一步反應是不可逆的，而且需要氧氣的參與。由於大塊的樣品內部氧氣供應不足，戊二醛在大塊樣品的內部無法形成穩定的生成物，會導致樣品內部的固定效果不佳。因而在使用戊二醛固定時，小塊的樣品固定效果較為理想。戊二醛通過交聯作用固定蛋白質的過程會伴隨氫離子的釋放，使樣品pH值降低。為了維持pH值穩定在最佳水平，在戊二醛的固定劑中要加入足量的緩衝液。
固定劑
固定劑用戊二醛前固定的樣品不易變脆，可以進行長時間固定（但最好不要超過一個星期），因而適用於遠離實驗室或野外現場取材。但戊二醛在稀釋溶液中會自行發生一系列反應，因而固定液應儘可能新鮮配製中。
其它固定劑
醋酸鈾（uranyl acetate）}既是一種固定劑又是一種染色劑。它可以與磷酸基團反應，從而固定DNA和RNA，以及含有磷酸基團的磷脂，從而對膜結構的保存有幫助。另外，它可以與蛋白中的酸性基團（如天冬氨酸殘基、谷氨酸殘基）和鹼性基團（如賴氨酸殘基）反應，從而起固定蛋白的作用。但醋酸鈾不能很好得保存糖原。通常在使用了醛類固定劑和四氧化鋨固定劑後，再使用$0.5-1.0\%$的醋酸鈾水溶液，進行第三重固定。操作醋酸鈾時要特別注意，儘管市售的醋酸鈾放射性不強，但它仍是一種潛在的致癌物。醋酸鈾應密封於棕色瓶陰涼處保存。
丙烯醛（acrolein）是一種三碳醛，含有一個醛基和一個雙鍵。它比甲醛和戊二醛活潑，滲透組織的速度也比甲醛和戊二醛快。它可以很好地保存蛋白和磷脂，最好作為甲醛或戊二醛固定液的添加劑使用。通常使用市售密封的100%丙烯醛液體，固定時使用的濃度小於1%。它溶於水的速度慢，毒性很大，著火點低，儲存和使用它都比上述另外兩種醛類危險，非必要時不推薦使用。丙烯醛非常活潑且揮發性很強，即使是操作稀釋後的溶液也要格外小心，所有與丙烯醛相關的操作絕不能離開通風櫥進行，並且最好有經驗豐富的操作者在場指導。丙烯醛適合於固定大塊的樣品，植物組織或有厚細胞壁的微生物樣品，以及表面覆蓋有幾丁質或蠟質的樣品。但丙烯醛不適用於整個動物的灌注固定。
丹寧酸（Tannic acid）是一種從植物中提取的物質，泛指五倍子酸（gallic acid）糖苷或多聚糖苷。大分子很難滲透到組織中，因此電鏡中使用低分子量的丹寧酸。丹寧酸既是一種強的固定劑，能固定許多蛋白以及糖類衍生物，又是一種媒染劑，能增強對重金屬（如鈾、鉛）的吸收，從而增強樣品反差，特別是細胞外膜、彈性纖維、細胞連線、肌肉纖維等。由於丹寧酸滲透速度慢，通常只用作滲透速度快的固定劑的添加劑使用。丹寧酸沒有固定的用法，0.5-2.0%丹寧酸和0.5mg/ml皂角苷（saponin，增加丹寧酸的滲透速度）與2.5-4.0\%戊二醛一起使用可以得到良好的效果。但固定時間要延長到3-4小時以上，並且推薦使用醋酸鈾作第三重固定。丹寧酸適用於灌注固定。
重鉻酸鉀（potassium dichromate）在固定中有兩種作用，一是緩衝作用，二是固定作用，幫助保存脂類和糖類。在處理神經組織樣品時，因為重鉻酸鉀能很好地保存髓磷脂，可與四氧化鋨配合使用，作為第二重固定劑。但需要注意的是，重鉻酸鉀是一種致癌物質，應小心操作。
高錳酸鉀（potassium permanganate）可以與脂類反應，增強膜結構的反差。可以保存DNA和糖原，但有一定的抽提作用，幾乎無法固定細胞內的顆粒性或纖維狀結構，可能會引入一些假象。穿透性強，適用於有厚細胞壁或蠟質層包被的植物及昆蟲樣品。使用時可以不加緩衝液，固定時間不宜太長，,0.5-1.0%高錳酸鉀溶液固定30分鐘到2小時。
固定劑配方
凝固型固定劑
1、酒精(ethyl，alcohol)
常用95%酒精及純酒精。酒精穿透力強，固定時間常在1小時以內。高濃度酒精有使材料收縮的作用。70%的酒精可作保存液。配製低度酒精必須要用普通酒精即95%的酒精，絕不可用純酒精。酒精為還原劑，不能與鉻酸、鋨酸、重鉻酸鉀等氧化劑配合。酒精可使核酸，蛋白質及肝醣等發生沉澱，但能溶解脂肪及擬脂。
固定劑
固定劑2、鉻酸(chromic acid)
鉻酸是一種很好的保存劑，可以使蛋白質沉澱，組織硬化，但是容易使組織收縮，同時滲透 亦比較緩慢。一般與其它藥劑混合使用，可以成為優良的固定劑。平常與醋酸合併套用，效果良好。特點：易潮解，為強氧化劑。缺點：滲透力弱，易使組織發生收縮。
3、苦味酸(picric acid)
苦味酸對於組織滲透緩慢，且能使組織強烈收縮。但可使蛋白質。核酸等沉澱，並防止過度硬化，對以後增進染色能力很大。一般很少單獨使用，常與其他藥劑混合使用。固定後需要用50%或70%酒精洗滌。特點：滲透力弱，易使組織發生收縮，易爆炸。注意事項：一般用50%或70%酒精洗滌。
4、醋酸(acetic acid)
醋酸為無色透明的液體，刺激性極強，冷則凝結成冰，故又叫冰醋酸。醋酸以與水和酒精配成各種比例的溶液，所用濃度為0.2～5%，也常與其他固定劑配合使用。醋酸穿透性很強，單獨使用，有使原生質膨脹的作用，故常與酒精，甲醛等合用，醋酸為固定染色體的優良固定液，因此固定染色體的固定液中，幾乎都含有醋酸。特點：滲透力強，可使組織產生膨脹作用。
非凝固型固定劑
1、 福馬林(formalin)
濃度在2～10%的福馬林，為很好的硬化劑，但是滲透力薄弱，而且對材料會引起強烈收縮。所以最好與其他藥劑混合使用，效果會大大增加。注意的是，它亦是一種還原劑，故不宜與氧化劑鉻酸、鋨酸相混。特點：很好的硬化劑，強還原劑；滲透力弱。
2、重鉻酸鉀(potassium dichromate)
用作固定劑的濃度1～3%。其水溶液略具酸性，亦為一種強氧化劑。因此不能與酒精、甲醛液等事先儲藏。同時為一種強烈的硬化劑，滲透力薄弱，所以很少單獨使用。特點：強氧化劑，強硬化劑；滲透力弱。常與其它固定劑配合使用。
3、鋨酸(osmic acid)
此物品十分昂貴，其溶液呈中性反應。是一種強烈的氧化劑，不能與酒精、甲醛液混用。鋨酸是目前植物製片中一種最好的固定劑，對細胞里細微的構造能夠良好的固定，並為脂肪性物質唯一固定劑。因此在線粒體及其他細胞器的研究中常常使用。經鋨酸固定後，又能防止用酒精脫水時所產生的沉澱作用。但此種固定劑滲透十分薄弱，同時不易固定均勻，往往外邊過度固定，而裡邊尚未固定完全。所以用作固定的材料應該愈小愈好。
4、戊二醛(glutaraldehyde)
混合型固定液
1、酒精-福馬林液
70% 酒精 100 ml
福馬林 2 -10 ml
固定植物一般組織，尤其用在柱頭中的萌發花粉管的固定。固定後的材料，立即用作觀察。通常固定24小時，可長久保存。
特點：不易收縮，常用於固定花粉管。
2、甲醛-醋酸-酒精液(FAA)
50% 或70% 酒精 9 0 ml
冰醋酸 5 ml
福馬林 5 ml
這個固定液在植物研究上，套用最多，為植物組織最常用的固定液。固定時間，不受限制，短為24小時，長可延至數月或數年。野外工作，非常便利。並且固定的材料，不妨礙染色。可用以固定植物的一般組織，但用作細胞學上的固定，不如其他一些專用的固定劑。經此液固定後的材料，可不必洗滌，直接用70%酒精脫水。
特點：過去稱“標準固定液”或“萬能固定液”；是組織形態中常用的固定液；同時可兼做保存液。
3、酒精-冰醋酸液
其中常用為卡諾液(Carnoy)
純酒精 15 ml
冰醋酸 5 ml
可用作植物組織及細胞的固定，通常固定2－24小時，視材料的大小而定。固定以後即用95%的酒精脫水；如用作細胞學上的塗片，固定後可直接回到70%酒精，然後進行操作。
特點：具強滲透力，作用迅速；常用於染色體壓片法的固定。
4、鉻酸-醋酸-福馬林液
又名納瓦興液(Nawashin)。1912年首創。常用為冷多夫(Randoph)改良液。
分為甲乙兩部分，用前等量混合。
此液在植物製片上套用甚廣，是細胞學及組織學上一種優良的固定液。此液原來的配方已很少套用，現所用的都是改良液，且種類很多，如材料較柔嫩，含水量較多，可用配方I、Ⅱ；材料較堅硬，含水量較少，可用Ⅳ、V 配方，其中配方Ⅱ對植物胚胎學製片特別適用。為了使用方便，常分別配成甲、乙兩種基液，用時臨時等量配合。固定時間為12-24小時，固定後用70%酒精洗滌數次。
特點：滲透慢，不能長期保存；主要用於顯示分裂相。
5、 精－醋酸－氯仿固定液（Carnoy fixative）
酒精 30毫升
氯仿 5毫升
冰醋酸 1毫升
6、 福馬林－丙酸－酒精液(Johansen fluid)
福馬林 5毫升
丙酸5毫升
50%酒精 90毫升
此液可用作固定一般植物組織。固定根尖細胞，用作染色體觀察。通常固定24小時，也可長期保存。
7、 鉻酸－醋酸固定液
三氧化鉻 1克
冰醋酸 1毫升
蒸餾水 100毫升
8、 鉻酸－醋酸－福馬林液（Licent fluid）
1%鉻酸 80毫升
醋酸 5毫升
福馬林 15毫升
