Realtime PCR溶解曲線

溶解曲線分析可以用來確定不同的反應產物,包括非特異性產物。

溶解曲線(Dissociation curve):隨溫度升高,DNA的雙螺旋結構降解程度的曲線。全部DNA雙螺旋結構降解一半的溫度稱為熔解溫度(Tm)。不同序列的DNA,Tm值不同。DNA中G-C含量越高,Tm值越高,成正比關係。不排除極度偶然的情況:1.兩個序列的熔解曲線一樣 2.沒有目標產物,只有一種非特異產物。

溶解曲線分析可以用來確定不同的反應產物,包括非特異性產物。擴增反應完成後,通過逐漸增加溫度同時監測每一步的螢光信號來產生溶解曲線,隨著反應中雙鏈DNA變性,螢光染料又回復到游離狀態導致螢光信號降低,用螢光信號改變的負的一次導數與溫度作圖,在擴增產物的溶解溫度上有一特徵峰(Tm,DNA雙鏈解鏈50%的溫度),用這個特徵峰就可以將特異產物與其它產物如引物二聚體區分開,因為它們在不同的溫度溶解.這個一般是用SYBY Green作為螢光染料的時候需要做的工作!因為SYBY Green染料是非特異的染料,只要有擴增,染料就可以鑲嵌在雙鏈中發出螢光。我們做溶解曲線是為了觀察我們擴增發出螢光的片段是不是我們需要的產物。如果溶解曲線做出來只有單峰,且出鋒位置是你的退火溫度,那么這個是你的產物發出的螢光,實驗結果有效。如果出現多鋒或退火溫度不對,那么這個實驗結果是不可信的!你需要再次調整!
溶解曲線是為了驗證擴增產物特異性的,要是溶解曲線是單峰說明產物只有一條,結果較好;要是雙峰說明產物不特異,可能存在引物二聚體或非特異性擴增,有可能你的引物設計有問題。

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