T-DNA

T一DNA（Transfer DNA）即轉移DNA，又名三螺旋DNA，是一種由三股ssDNA旋轉螺旋形成的一種特殊脫氧核糖核苷酸結構。

T一DNA是Ti質粒上的一個片段。利用農桿菌等微生物可將人工合成的目的基因片段通過T-DNA載體轉移到受體植物的基因組中，是基因工程的重要技術手段。

T一DNA上有三套基因，其中兩套基因分別控制合成植物生長素與分裂素，促使植物創傷組織無限制地生長與分裂，形成冠癭瘤。第三套基因合成冠癭鹼。T一DNA技術是構建突變體庫，反向遺傳學的突破性技術之一。

基本介紹

• 中文名：三螺旋脫氧核糖核苷酸
• 外文名：T一DNA，Transfer DNA
• 用途：基因工程
• 套用學科：生物學，遺傳學，分子生物學

基本介紹

轉移DNA（Transfer DNA，T一DNA）：T一DNA也叫三螺旋DNA，是指一種由三股ssDNA旋轉螺旋形成的一種特殊結構。農桿菌Ti(tumor inducing)或Ri(root inducing)質粒中的一段DNA序列，可以從農桿菌中轉移並穩定整合到植物核基因組中。

T-DNA - 農桿菌的Ti質粒與T-DNA 的整合機制

農桿菌Ti(tumor inducing)或Ri(root inducing)質粒已成為植物分子生物學中廣泛套用的遺傳轉化載體。T一DNA是Ti質粒上的片斷，包含三個重要的基因，當整合到宿主細胞（主要是雙子葉植物）時分別誘發根瘤，opine化合物的合成和抑制細胞分化。 Ti質粒因為自身一些優點很適合作為導入外源基因的載體。而外基因就是整合到T一DNA上的。

一切基因工程載體都是由某種細菌質粒或病毒來充任， 而在眾多的載體中目前僅有 Ti 質粒在轉化植物受體方面取得較多的成功。所以 Ti 質粒是當前植物基因工程中最常用的載體系統。農桿菌侵染植物後，Ti 質粒中的 T一DNA區段脫離質粒而整合到受體植物的染色體上。因此，如果把外源基因插入T一DNA中，就有可能攜帶進入受體植物並整合到染色體上。

結構

幾乎所有雙子葉植物都容易受到土壤農桿菌感染，而產生根瘤。它是一種革蘭氏陰性菌（A. tumefaciens）。其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）質粒介導的。農桿根瘤菌之所以會感染植物根部是因為植物根部損傷部位分泌出酚類物質乙醯丁香酮和羥基乙醯丁香酮，這些酚類物質可以誘導Vir（Virulence region)基因的啟動表達，Vir基因的產物將Ti質粒上的一段T一DNA單鏈切下，而位於根瘤染色體上的操縱子基因產物則與單鏈T一DNA結合，形成複合物，轉化植物根部細胞。T一DNA上有三套基因，其中兩套基因分別控制合成植物生長素與分裂素，促使植物創傷組織無限制地生長與分裂，形成冠癭瘤。第三套基因合成冠癭鹼，冠癭鹼有四種類型：章魚鹼（octopine）、胭脂鹼（nopaline）、農桿鹼（agropine）、琥珀鹼（succinamopine），是農桿菌生長必需的物質。

Ti質粒的結構

在發現根瘤農桿菌誘發冠癭瘤的本質是Ti質粒後，Ti質粒便成為冠癭瘤形成基因鑑定與分析的主要研究對象。

Ti質粒大約在160～240kB之間。其中T一DNA大約在15kb-30kb。Vir基因區在36kb左右。除此之外，Ti質粒上還存在Con區（region encoding conjugation)和Ori區（origin of replication)。c. Ti質粒約為200kb，重組操作非常苦難，也很難找到單一的酶切位點。d. Ti質粒不能在大腸桿菌中複製，為了使重組質粒DNA 的大量擴增，須添加入大腸桿菌複製子。 加入植物細胞的篩選標記，如neor基因，使用植物細胞啟動子及末端polyA化信號，加入多聚人工接頭以利於外源基因的。

植物中一般不存在質粒，為利用農桿菌的Ti質粒，發展了共整合系統和雙元載體系統，避免了在大的Ti質粒上進行分子重組操作的困難。

植物細胞轉化的共整合系統

T一DNA在大腸桿菌質粒上，含有E.coli的選擇標記和植物選擇標記Kmr。首先在E.coli中篩選重組分子，然後將重組質粒轉化到農桿菌中，質粒與Ti質粒上的同源序列發生同源重組，將外源基因整合到Ti質粒上，用於侵染植物細胞。T一DNA重組分子整合到植物細胞染色體DNA 上，Kmr篩選轉化細胞。

.植物細胞轉化的雙元系統

目前T一DNA轉化植物細胞的標準方法是雙元系統，即穿梭質粒。插入外源基因的重組穿梭質粒直接轉化含有Ti質粒的根瘤農桿菌，經篩選後直接感染植物細胞。與共整合系統所不同的是，含外源基因的質粒可在農桿菌內自主複製並保留下來。農桿菌侵染植物細胞後，植物的創傷信號啟動Ti質粒上的Vir基因，隨後將穿梭質粒的T一DNA切割下來，轉移到植物細胞中。

T一DNA上共有三套基因和左右兩個邊界，LB和RB是長為25bp的末端反覆重複順序，在切除及整合過程具有重要意義。

tms由兩個組成：tms1（iaaM）和tms2（iaaH）

tmr由一個組成iptz：

tmt由若干基因構成，合成稀有胺基酸衍生物，稱為opines。它有三個成員：octopine=精氨酸與丙酮酸的縮合物 ，Napaline=精氨酸與－酮戊二酸的縮合物，Agropine=谷氨酸與二環糖的縮合物。

據此可將Ti質粒分為三大類，感染的植物誘導合成這些有機鹼，但不能利用它們，其分解酶基因在Ti質粒上，分解產物為胺基酸和糖類，供根癌農桿菌使用作為氮源及碳源。

2.T一DNA的整合機制：T一DNA的詳細整合機制尚不清楚，但有幾個環節是明確的：

T一DNA切除由Vir區編碼的特異性內切酶完成，分別在LB和RB的第三個鹼基和第四個鹼基之間產生缺口，並形成單鏈T一DNA。

T一DNA的LB和RB在整合中的作用是不對稱的，RB順序與整合有關，而LB無關。

T一DNA的整合可以是單拷貝的，也可以是多拷貝的，成串聯形式排列，但整合位點的特異性尚未確定。