SYBR Green I是一種結合於所有dsDNA雙螺旋小溝區域的具有綠色激發波長的染料。在游離狀態下，SYBR Green I發出微弱的螢光，但一旦與雙鏈DNA結合後，螢光大大增強。因此，SYBR Green I的螢光信號強度與雙鏈DNA的數量相關，可以根據螢光信號檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數量。SYBR Green I 的最大吸收波長約為497nm，發射波長最大約為520nm。
基本介紹
- 中文名：SYBR Green I
- 特點：具有綠色激發波長
- 性質：染料
- 操作：無須脫色或沖洗
主要用途,主要特點,使用方法,預染方法,後染方法,注意事項,操作過程,
主要用途
SYBR Green I是高靈敏的DNA螢光染料，適用於各種電泳分析，操作簡單：無須脫色或沖洗。至少可檢出20pg DNA，高於EB染色法25-100倍。SYBR Green I 與dsDNA 結合螢光信號會增強800-1000倍，用SYBR Green I染色的凝膠樣品螢光信號強，背景信號低。可適用於多種電泳分析。
SYBR Green I 與雙鏈DNA的親和力非常高，因此可以用做電泳前染色，對分子生物學中常用的酶（如：Taq 酶、逆轉錄酶、內切酶、T4連線酶等）沒有抑制作用。另外，SYBR Green I 與EB相比，誘變能力大大降低。
SYBR Green I 核酸凝膠染液(SYBR Green Nucleic Acid Gel Stains)是一種高敏感性的螢光染液，用於檢測瓊脂糖凝膠及聚丙烯醯胺凝膠中的雙鏈DNA和寡核苷酸。當染液與核酸結合後，SYBR Green I 核酸凝膠染液的螢光信號會明顯增強，因此經SYBR GreenI 核酸凝膠染液染色的凝膠顯示出非常好的信噪比，沒有背景螢光。為獲得最佳的結果，凝膠最好在跑膠後再進行染色。SYBR GreenI 核酸凝膠染液用於低含量的PCR產物，凋亡研究及異源雙鏈分析中少量DNA的檢測較為理想。可套用於：DNA和RNA的檢測；SSCP及異源雙鏈分析。
主要特點
高靈敏：至少可檢出20pg DNA，高於EB染色法25-100倍。
信噪比高：樣品螢光信號強，背景信號低。
操作簡單：無須脫色或沖洗。
適用範圍廣：可適用於多種電泳分析。
使用方便：不影響其它修飾酶作用。
經濟：價格比銀染便宜。
使用方法
預染方法
1. 該方法適用於瓊脂糖凝膠電泳和PAGE凝膠電泳
2. 工作液的配製：用電泳緩衝液將10000×的SYBR GreenⅠ稀釋100倍，即為SYBR GreenⅠ工作液。SYBR GreenⅠ工作液可以置2-8℃冷藏一個月以上。
3. 制膠：按常規方法制膠，不含任何染料。
4. 樣品染色：向分析樣品中加入SYBR GreenⅠ工作液和載樣緩衝液，室溫放置10分鐘，使SYBR GreenⅠ與樣品中DNA充分結合。SYBR GreenⅠ工作液加入量為總上樣量的1/10。
5. DNA Marker染色：將5μL DNA Marker和1μLSYBR GreenⅠ工作液混勻，室溫放置5分鐘，使SYBR GreenⅠ與DNA充分結合。
6. 上樣、電泳：按常規操作。
7.檢測：用ABLUe可見光核酸檢測儀器檢測
後染方法
1. 按照常規方法進行電泳。
2. 用PH 7.0 - 8.5 的緩衝液（如：TAE，TBE 或 TE），按照10000：1的比例稀釋SYBR GreenⅠ濃縮液，混勻，製成染色溶液。
3. 將染色溶液倒入合適的聚丙烯容器中，放入凝膠，用鋁箔等蓋住容器使染料避光。室溫振盪染色10-30分鐘，染色時間因凝膠濃度和厚度而定。聚丙烯醯胺凝膠直接在玻璃平皿上染色，將配好的工作溶液輕輕地倒在膠板上，讓工作液均勻地覆蓋整個膠板，並染色30分鐘。玻璃平皿必須預先經過矽烷化溶液處理（避免染料吸附在玻璃表面上）。
4. 用ABLUe觀測。藍光可透過玻璃，觀測聚丙烯醯胺凝膠時，可直接將托有凝膠的玻璃平皿放入ablue內觀測。
注意事項
1. 在"SYBR GreenⅠ預染色方法"中，電泳時間不要超過2小時，否則SYBR GreenⅠ會從DNA上分離出來，會產生彌散狀條帶。
2. 在常規用酒精沉澱核酸的過程中，SYBR Green I 可以全部從雙鏈核酸上去掉。
3. 如果想對用 SYBR Green I 染過的膠進行 Southern blots，建議在預雜化和雜化溶液中加入 0.1%- 0.3% 的SDS。
4. 在紫外照射透視下，與雙鏈 DNA 接合的 SYBR Green I 呈現綠色螢光。如果膠中含有單鏈 DNA 則顏色為橘黃而不是綠色。
5. SYBR Green對玻璃和非聚丙烯材料具有一定親合力。建議在稀釋、貯存、染色等使用過程中用聚丙烯類容器。
操作過程
1實驗方法
囊腔組織經液氮速凍後，放入-70℃冰櫃保存備用。Real-time PCR法檢測EMMPRIN的mRNA含量。
1.1組織總RNA提取：
（1）從液氮中取出組織，用已處理過的剪刀剪取約100mg組織塊，加入1ml Trizol試劑，轉移至勻漿器中，將勻漿器置於冰水上充分研磨，轉移研磨好的勻漿液至無RNA酶/無DNA酶的1.5ml離心管中，室溫下靜置5min。
（2）加入0.2ml氯仿，顛倒混勻10次充分混勻，室溫下靜置2-5min，4℃狀態下進行離心，離心速度為12000r/min，離心時間10min；
（3）小心吸取上層水相溶液至另一無RNA酶/無DNA酶的1.5ml離心管中，小心吸取上層水相，勿碰及或吸走中間層，否則要重新離心再吸取（可吸取約0.4-0.5 ml）。
（4）加入等體積異丙醇，顛倒混勻後室溫下靜止15min，4℃狀態下進行離心，離心速度為12000r/min，離心時間15min。小心棄上清，沿管壁加入1ml 75%乙醇（DEPC水配置,預冷），室溫下靜置1min，4℃狀態下離心，速度7500r/min，離心時間5min；小心倒掉上清，再4℃狀態下離心，速度3500r/min，時間離心1min；離心後用10μl槍頭小心吸去殘餘液體，最後用30μlDEPC-H2O溶解RNA。
（5）提取的總RNA經紫外分光光度計測定，提取物濃度OD 260/280比值在1.8-2.0之間。
1.2逆轉錄反應：
用上述細胞中提取的2μg總RNA在下述20μl反應體系中逆轉錄成cDNA,該反應體系組成如下：5×RT-Buffer 4μl, oligd(T) 2.5μmol/L, dNTPs 5mmol/L, RNA酶抑制劑（RNAsin) 20U。首先70?C預變性5min，然後加入逆轉錄酶MMLV 200U， 再於42?C孵育1h，72?C加熱10min滅活逆轉錄酶。
1.3 Real-time PCR 反應：
1.3.1 方法學確認 根據引物相關信息PCR擴增，PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析並且對其純化，假設純化所得DNA濃度為a×10x，對其做10倍梯度稀釋7次，稀釋濃度依次為a×10x-1、a×10x-2、a×10x-3、a×10x-4、a×10x-5、a×10x-6、a×10x-7選擇合適稀釋品作為標準品模板。
1.3.2 取上述逆轉錄反應產物於20μl反應體系中進行PCR反應。PCR引物由上海之江生物科技有限公司合成。
PrimerSequence (5′to 3′)Length（bp）
GAPDH Forward primer5'-GTCGGTGTGAACGGATTT-3'276
GAPDH Reverse primer5'-ACTCCACGACGTACTCAGC-3'
EMMPRINForward primer5’- TGGCCTTCACGTTCCTGAGT -3’215
EMMPRINReverse primer5’ - GTCATCTGCATCCACCGTGT-3’
反應體系組成如下：10×Buffer（2μl）、dNTP 10 mmol /L(0.4μl)、MgCl2 25mmol/L (1.6μl)、5U TaqDNA多聚酶(0.3μl)、模板2μl、上、下游特異引物各0.25μl、去離子水16.2μl。
按下述熱循環參數運行：GAPDH內參照基因；預變性：94×2min；變性：94×2s，退火56×15s，延伸72×15S（採光） 共30個循環。EMMPRIN基因；預變性：94×2min；變性：94×2s，退火58×15s，延伸72×12s （採光）共35個循環。以SLAN軟體分析並計算目的基因EMMPRIN與GAPDH的Ct值。
2 實驗結果
2.1內參照基因、目的基因瓊脂糖凝膠電泳結果：隨機選擇3份標本PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，在理論片段大小位置有單一條帶且無雜帶和引物二聚體。
2.2 試劑擴增效率驗證：經過對標準品定量，內參照基因GAPDH擴增檢測Ct值與濃度對數值的相關係數為0.99996，目的基因EMMPRIN擴增檢測Ct值與濃度對數值的相關係數為0.99969。內參照基因和目的基因皆有良好的擴增效率（相關係數>0.98）。可用ΔCt法行數據統計。
