基本介紹
- 中文名：基因測序儀
- 外文名：Gene Sequencer
原理,分類,臨床套用,發展歷史,擴展閱讀,
原理
目前DNA測序儀的工作原理主要基於Sanger發明的雙脫氧鏈末端終止法或Maxam-Gilbert發明的化學降解法。這兩種方法在原理上雖然不同，但都是根據在某一固定的位點開始核苷酸鏈的延伸，隨機在某一個特定的鹼基處終止，產生以A、T、C、G為末端的四組不同長度的一系列核苷酸鏈，在變性聚丙烯醯胺凝膠上電泳進行片段的分離和檢測，從而獲得DNA序列。由於雙脫氧鏈末端終止法更簡便和更適合於光學自動探測，因此在單純以測定DNA序列為目的的全自動DNA測序儀中套用廣泛。而化學降解法在研究DNA的二級結構以及蛋白質-DNA相互作用中具有重要的套用價值。這裡主要介紹雙脫氧鏈末端終止法的測序原理。
雙脫氧鏈末端終止法測序是利用DNA的體外合成過程-聚合酶鏈反應，在DNA聚合酶的催化作用下，以目的DNA為模板，按照鹼基互補配對原則，在引物的引導下完成。
普通的PCR反應體系中，加入的核苷酸單體為4種2′-脫氧核苷三磷酸(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)。測序反應體系中，加入的核苷酸單體為2',3雙脫氧核苷三磷酸( ddNTP)。與dNTP相比，ddNTP在脫氧核糖的位置上缺少個羥基，反應過程中雖然可以在DNA聚合酶作用下，通過其磷酸基團與正在延伸的DNA鏈的末端脫氧核糖-OH發生反應，形成磷酸二酯鍵而摻入到DNA鏈中，但它們本身沒有-OH，不能同後續的dNTP形成磷酸二酯鍵，從而使正在延伸的DNA鏈在此終止。
根據這一原理分別設計四個反應體系，每一反應體系中存在相同的DNA模板、引物、四種dNTP和一種ddNTP(如ddATP)，則新合成的DNA鏈在可能摻入正常dNTP的位置都有可能摻入ddNTP，導致新合成鏈在不同的位置終止。由於存在ddNTP與dNTP的競爭，生成的反應產物是一系列長度不同的多核苷酸片段。
將製得的四組混合物全部平行地點加在電泳板上進行電泳，每組製品中的各個組分將按其鏈長的不同得到分離，從而製得相應的放射性自顯影圖譜。從所得圖譜即可直接讀得DNA的鹼基序列，如圖所示。
Sanger雙脫氧鏈末端終止法分類
根據電泳類型分為平板型電泳和毛細管電泳兩類：
1. 平板型電泳：平板型電泳的凝膠灌制在兩塊玻璃板中，聚合後厚度一般小於0.4mm或更薄，因此又稱為超薄片層凝膠電泳。是經典的電泳技術，具有樣品判讀序列長（600-900bp）、一塊凝膠板上可同時進行多個樣品測序的優點。
2. 毛細管電泳：將凝膠高分子聚合物灌制於毛細管中(內徑50~100um)，在高壓及較低濃度膠的條件下實現DNA片段的快速分離。是一種快速、高效、進樣量少、靈敏度高的技術，可測序列達到750bp左右。
臨床套用
1. 在感染性疾病診斷上的套用
測序技術可以精確的分析鹼基序列，通過序列比對，對各種病原體直接進行鑑定、分型和溯源，明確某一感染性疾病對應病原體的基因序列，可以有針對性地用藥和預防，提高用藥的有效性和安全性。同時基因測序可以用於發現新型病原體，能更好地做好預防工作。
2. 在遺傳性疾病診斷上的套用
由於基因突變而導致的疾病具有遺傳性和終身性的特點，一旦患上這種病，會給自身和整個家族帶來痛苦。通過對被檢人員進行基因測序，查看基因突變情況，判斷是否存在基因遺傳病，或者推斷後代患病的機率為婚育提供指導，減少遺傳性疾病的發病率。
3. 在腫瘤診斷上的套用
腫瘤的發生是遺傳基因和環境因素共同作用的結果，其中遺傳基因是內因，與人體是否具有腫瘤易感基因有關。腫瘤易感基因的檢測可以檢測出人體內是否存在腫瘤易感基因或家族聚集性的致癌因素，根據個人情況給出人性化的指導方案。
4. 在藥物易感基因上的套用
個體基因型的差異可能會使相同的藥物有不同的用藥結果，確定患者相應的基因型實現更精準的用藥，更大程度的提高用藥效果。
5. 在無創產前篩查上的套用
抽取孕婦血液可以檢測出胎兒的基因，通過基因測序對胎兒進行產前篩查，提前知曉胎兒的健康狀態，例如針對唐氏綜合徵的篩查。
發展歷史
1. 第一代DNA測序技術
1977年，Sanger等提出了經典的雙脫氧核苷酸末端終止測序法。此後，在Sanger法的基礎上，20世紀80年代中期出現了以螢光標記代替放射性同位素標記、以螢光信號接收器和計算機信號分析系統代替放射性自顯影的自動測序儀。另外，90年代中期出現的毛細管電泳技術使得測序的通量大為提高。
傳統的第一代測序技術具有高準確性和簡單、快捷等優點，但由於測序通量低，僅適用於小樣本遺傳疾病基因的鑑定，難以完成沒有明確候選基因或候選基因數量較多的大樣本病例篩查。
2. 第二代DNA測序技術
進入21世紀後，第二代測序技術誕生。主要是將片段化的基因組DNA兩側連上接頭，隨後用不同的方法產生幾百萬個空間固定的PCR克隆陣列。然後進行引物雜交和酶延伸反應。經過計算機分析獲得完整的DNA序列信息。
與第一代技術相比，第二代測序技術不僅保持了高準確度，而且大大降低了測序成本並極大地提高了測序速度。第二代測序技術最顯著的特徵是高通量，一次能對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測序，使得對一個物種的轉錄組測序或基因組深度測序變得方便易行。
3. 第三代DNA測序技術
第三代測序技術的顯著特徵是長讀長，在保持高準確度的同時可明顯將測序讀長再提高10-50倍。第三代測序技術解決了第二代測序技術在測序文庫製備時所必需的PCR放大過程，一定程度上消除了PCR所引入的系統誤差，同時也減少了整體實驗運行時間。
4. 第四代DNA測序技術
第四代DNA測序技術同樣屬於單分子測序，但其利用納米孔晶片檢測單分子測序信號的技術原理不再依賴高速攝像機或者高解析度的CCD相機，最大程度上降低了檢測設備的成本。大多數納米孔測序技術的基本原理是當DNA分子從一個孔洞經過時檢測到被影響的電流或光信號。由於與第三代測序技術相比具有質的飛躍，通常稱之為第四代測序技術。
擴展閱讀
[1] 陳丹, 劉根焰, 徐建, 等. 基因測序技術及其臨床套用[J/CD].中華臨床實驗室管理電子雜誌, 2014, 2(4): 216-222.
