霍亂弧菌

霍亂弧菌

霍亂弧菌(Vibrio cholerae)是革蘭氏陰性菌,菌體短小呈逗點狀,有單鞭毛、菌毛,部分有莢膜。共分為139個血清群,其中O1群和O139群可引起霍亂。

霍亂弧菌是人類霍亂的病原體,霍亂是一種古老且流行廣泛的烈性傳染病之一。曾在世界上引起多次大流行,主要表現為劇烈的嘔吐,腹瀉,失水,死亡率甚高。屬於國際檢疫傳染病。

基本介紹

  • 中文名:霍亂弧菌
  • 外文名:V.cholera
  • 病毒:人類霍亂的病原體
  • 生物型:古典生物型和埃爾托生物型
  • 形態特徵:菌體彎曲呈弧狀或逗點狀
  • 抵抗力:耐低溫,耐鹼
  • 感染後症狀:引起烈性腸道傳染病霍亂
簡介,性狀,形態與培養特性,抗原性,抵抗力,檢測方法,生化鑑定,血清凝集法,聚合酶鏈反應法,基因晶片,症狀,致病因素,所致疾病,免疫性,診斷,直接鏡檢,細菌分離培養,特異性制動試驗,免疫螢光試驗,特徵,發病機制,防治原則,

簡介

弧菌屬(Vibrio)中霍亂弧菌(V.cholerae)、引起一種烈性腸道傳染病,發病急、傳染性強、病死率高,屬於國際檢疫傳染病。
霍亂弧菌包括兩個生物型:古典生物型(Classical biotype)和埃爾托生物型(EL-Tor bio-type)。這兩種型別除個別生物學性狀稍有不同外,形態和免疫學性基本相同,在臨床病理及流行病學特徵上沒有本質的差別。自1817年以來,全球共發生了七次世界性大流行,前六次病原是古典型霍亂弧菌,第七次病原是埃爾托型所致。
霍亂弧菌霍亂弧菌
1992年10月在印度東南部又發現了一個引起霍亂流行的新血清型菌株(0139),它引起的霍亂在臨床表現及傳播方式上與古典型霍亂完全相同,但不能被01群霍亂弧菌診斷血清所凝集,抗01群的抗血清對0139菌株無保護性免疫。在水中的存活時間較01群霍亂弧菌長,因而有可能成為引起世界性霍亂流行的新菌株。

性狀

形態與培養特性

新從病人分離出古典型霍亂弧菌和ELtor弧菌比較典型,為革蘭氏陰性菌,菌體彎曲呈弧狀或逗點狀,菌體一端有單根鞭毛和菌毛,無莢膜與芽胞。經人工培養後,易失去弧形而呈桿狀。取霍亂病人米泔水樣糞便作活菌懸滴觀察,可見細菌運動極為活潑,呈流星穿梭運動。在液體培養基內常呈單個、成對成鏈狀,有的相連呈S形,甚至螺旋狀。
營養要求不高,在PH8.8~9.0的鹼性蛋白腖水或平板中生長良好。因其他細菌在這一PH不易生長,故鹼性蛋白腖水可作為選擇性增殖霍亂弧菌的培養基。在鹼性平板上菌落直徑為2mm,圓形,光滑,透明。
霍亂弧菌霍亂弧菌
霍亂弧菌能還原硝酸鹽亞硝酸鹽,靛基質反應陽性,當培養在含硝酸鹽及色氨酸的培養基中,產生靛基質與亞硝酸鹽,在濃硫酸存在時,生成紅色,稱為霍亂紅反應,但其他非致病性弧菌亦有此反應,故不能憑此鑑定霍亂弧菌。EL Tor型霍亂弧菌與古典型霍亂弧菌生化反應有所不同。前者Vp陽性而後者為陰性。前者能產生強烈的溶血素,溶解羊紅細胞,在血平板上生長的菌落周圍出現明顯的透明溶血環,古典型霍亂弧菌則不溶解羊紅細胞。個別EL Tor型霍亂弧菌株亦不溶血。

抗原性

根據弧菌O抗原不同,分成Ⅵ個血清群,第Ⅰ群包括霍亂弧菌的兩個生物型。第Ⅰ群A、B、C三種抗原成份可將霍亂弧菌分為三個血清型:含AC者為原型(又稱稻葉型),含AB者為異型(又稱小川型),A、B、C均有者稱中間型(彥島型)。

抵抗力

霍亂弧菌古典生物型對外環境抵抗力較弱,EL-Tor生物型抵抗力較強,在河水、井水、海水中可存活1~3周,在鮮魚,貝殼類食物上存活1~2周。
霍亂弧菌對熱,乾燥,日光,化學消毒劑和酸均很敏感,耐低溫,耐鹼。濕熱55℃,15分鐘,100℃,1~2分鐘,水中加0.5ppm氯15分鐘可被殺死。0.1%高錳酸鉀浸泡蔬菜、水果可達到消毒目的。在正常胃酸中僅生存4分鐘。

檢測方法

生化鑑定

能發酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、半乳糖等產酸產氣,遲緩發酵乳糖。不分解阿拉伯糖、水楊素、衛矛醇、鼠李糖、木糖、側金盞花醇和肌醇。氧化酶、明膠液化試驗陽性。V-P試驗大多數EL-Tor生物型陽性,而古典生物型大多為陰性。霍亂弧菌能分解色氨酸產生吲哚,同時能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽。因此當霍亂弧菌培養在含硝酸鹽的蛋白腖水中,所產生的亞硝酸鹽與吲哚結合成亞硝基吲哚,滴加濃硫酸即出現薔薇色,稱為霍亂紅試驗陽性。

血清凝集法

根據弧菌O抗原不同,分成Ⅵ個血清群,第Ⅰ群包括霍亂弧菌的兩個生物型。第Ⅰ群A、B、C三種抗原成份可將霍亂弧菌分為三個血清型:含AC者為原型(又稱稻葉型),含AB者為異型(又稱小川型),A、B、C均有者稱中間型(彥島型)。
1992年10月在印度東南部又發現了一個引起霍亂流行的新血清型菌株(0139),它引起的霍亂在臨床表現及傳播方式上與古典型霍亂完全相同,但不能被01群霍亂弧菌診斷血清所凝集,抗01群的抗血清對0139菌株無保護性免疫。在水中的存活時間較01群霍亂弧菌長,因而有可能成為引起世界性霍亂流行的新菌株,推薦使用天津生物晶片生產的霍亂弧菌診斷血清。

聚合酶鏈反應法

1,普通聚合酶鏈反應法
核酸擴增技術,即聚合酶鏈式反應(polymerase chainreaction,PCR),其基本原理是設計、合成兩條寡核苷酸,作為引物,對應於待測病原微生物某一段特異性序列的兩端,然後在體外模擬DNA體內複製的過程反覆擴增,使靶序列放大上萬倍甚至上百萬倍而被檢測出來。一般選擇霍亂腸毒素(cholera enterotoxin,CT)基因ctx的保守序列作為靶基因。一些非產毒株(如環境來源的菌株)有可能通過基因水平轉移獲得毒力基因成為產毒株,若僅檢測ctx基因容易造成漏檢。因此,霍亂弧菌的其他重要基因,如毒力協同調節菌毛A基因(tcp A)、o抗原基因(rfb)、外膜蛋白基因(omp)以及毒力表達調控基因(toxR)等也被選用為PcR的靶基因,這大大提高了檢測的特異度.
2 ,多重PCR法
與常規PCR相比,多重PCR一次反應可檢測多個基因,節省了時間和成本。國內、外許多學者選用霍亂弧菌的毒素基因ctx、tcp與其他基因如ompW、rfb、hly進行組合,作為共同的靶基因,克服了由於毒力基因特異度不夠高而造成的假陽性。多重PcR同時可準確區分不同血清型的霍亂弧菌和快速鑑定其是否為產毒株,可謂一舉多得,大大提高了檢測效率。
3.螢光定量PCR法
螢光定量PCR自動化程度高、特異性強、無交叉污染,在霍亂弧菌的快速診斷中得到廣泛套用。尤其是近年來,隨著引物與探針的設計更精確、多通道螢光PCR儀的開發與廣泛使用,多重螢光定量PCR技術日臻成熟,並以其高通量、低成本、高效率等優點而廣泛套用於病毒、細菌、真菌等多種病原體的快速檢測,成為套用的熱點.

基因晶片

與PCR方法相比,基因晶片技術能同時獲得更多病原學、生物學方面的信息,從而更為全面地分析、掌握病原微生物的特徵。Vora等[12]運用基因晶片技術對多種致病性弧菌的毒力、毒素、耐藥基因及潛在的毒力基因進行全面分析,對掌握這些細菌的致病性及進行有效預防、控制等具有重要意義。但基因晶片成本較高,距離推廣套用尚需時間等待。

症狀

人類在自然情況下是霍亂弧菌的唯一易感者,主要通過污染的水源或飲食物經口傳染。在一定條件下,霍亂弧菌進入小腸後,依靠鞭毛的運動,穿過黏膜表面的粘液層,可能藉菌毛作用粘附於腸壁上皮細胞上,在腸黏膜表面迅速繁殖,經過短暫的潛伏期後便急驟發病。該菌不侵入腸上皮細胞和腸腺,也不侵入血流,僅在局部繁殖和產生霍亂腸毒素,此毒素作用於黏膜上皮細胞與腸腺使腸液過度分泌,從而患者出現上吐下瀉,瀉出物呈“米泔水樣”並含大量弧菌,此為本病典型的特徵
霍亂腸毒素本質是蛋白質,不耐熱,56℃經30分鐘,即可破壞其活性。對蛋白酶敏感而對胰蛋白酶抵抗。該毒素屬外毒素,具有很強的抗原性。現已能將該毒素高度精製成晶狀,仍保持極強的生物學活性。霍亂腸毒素致病機理如下:毒素由A和B兩個亞單位組成,A亞單位又分為A1和A2兩個肽鏈,兩者依靠二硫鏈連線。A亞單位為毒性單位,其中A1肽鏈具有酶活性,A2肽鏈與B亞單位結合參與受體介導的內吞作用中的轉位作用。B亞單位為結合單位,能特異地識別腸上皮細胞上的受體。1個毒素分子由一個A亞單位和4℃6個B亞單位組成多聚體。霍亂腸毒素作用於腸細胞膜表面上的受體(由神經節苷脂GM1組成),其B亞單位與受體結合,使毒素分子變構,A精緻單位進入細胞,A1肽鏈活化,進而激活腺苷環化酶(AC),使三磷酸腺苷(ATP)轉化為環磷酸腺苷(cAMP),細胞內 cAMP濃度增高,導致腸黏膜細胞分泌功能大為亢進,使大量體液電解質進入腸腔而發生劇烈吐瀉,由於大量脫水和失鹽,可發生代謝性酸中毒,血循環衰竭,甚至休克或死亡。
霍亂腸毒素的作用機制霍亂腸毒素的作用機制

致病因素

霍亂弧菌產生腸毒素,是一種劇烈的致泄毒素。該毒素作用於腸壁促使腸黏膜細胞極度分泌從而使水和鹽過量排出,導致嚴重脫水虛脫;進而引起代謝性酸中毒和急性腎功能衰竭。

所致疾病

引起烈性腸道傳染病霍亂,為我國的甲類法定傳染病。在自然情況下,人類是霍亂弧菌的唯一易感者。在地方性流行區,除病人外,無症狀感染者也是重要傳染源。高比例的無症狀攜帶者有利於疾病的擴散,根據衛生狀況,無症狀攜帶者和病人的比率波動在10:1~100:1之間。
傳播途徑主要是通過污染的水源或未煮熟的食物如海產品、蔬菜經口攝入。居住擁擠,衛生狀況差,特別是公用水源是造成暴發流行的重要因素。人與人之間的直接傳播不常見。在正常胃酸條件下,如以水為載體,需飲入大於1010個細菌方能引起感染;如以食物作為載體,由於食物高強度的緩衝能力,感染劑量可減少到102~104個細菌。任何能降低胃中酸度的藥物或其他原因,都可使人對霍亂弧菌感染的敏感性增加。
病菌到達小腸後,粘附於腸黏膜表面並迅速繁殖,不侵入腸上皮細胞和腸腺,細菌在繁殖過程中產生腸毒素而致病。O1群霍亂弧菌感染可從無症狀或輕型腹瀉到嚴重的致死性腹瀉。在古典生物型霍亂弧菌感染中,無症狀者可達60%,在El Tor生物型感染中,無症狀者可達75%。霍亂弧菌古典生物型所致疾病較El Tor生物型嚴重。典型病例一般在吞食細菌後2~3天突然出現劇烈腹瀉和嘔吐,多無腹痛,每天大便數次或數十次。在疾病最嚴重時,每小時失水量可高達1升,排出由黏膜、上皮細胞和大量弧菌構成的如米泔水樣的腹瀉物。由於大量水分和電解質喪失而導致失水,代謝性酸中毒,低鹼血症和低容量性休克及心力不齊和腎衰竭,如未經治療處理,病人可在12~24小時內死亡,死亡率高達25%~60%,但若及時給病人補充液體及電解質,死亡率可小於1%。O139群霍亂弧菌感染比O1群嚴重,表現為嚴重脫水和高死亡率,且成人病例所占比例較高,大於70%,而O1群霍亂弧菌流行高峰期,兒童病例約占60%。
病癒後一些患者可短期帶菌,一般不超過3~4周,真正的慢性帶菌者罕見。病菌主要存在於膽囊中。

免疫性

患過霍亂的人可獲得牢固的免疫力,再感染者少見。病人在發病數日,血液中即可出現特異性抗體,7℃14天抗體滴度達高峰,隨後逐漸下降至較低水平,但能持續約3個月之外。病後小腸內可出現分泌型lgA。體液抗體與免疫的關係尚不清楚,一般認為局部SlgA可在腸黏膜與病菌之間形成免疫屏障,有阻斷粘附和中和毒素的作用。

診斷

由於霍亂流行迅速,且在流行期間發病率及死亡率均高,危害極大,因此早期迅速和正確的診斷,對治療和預防本病的蔓延有重大意義。

直接鏡檢

採取病人“米泔水樣”大便或嘔吐物。鏡檢(塗片染色及懸滴法檢查)觀察細菌形態,動力特徵。

細菌分離培養

可將材料接種至鹼性蛋白腖水37℃培養6~8小時後,取生長物作形態觀察,並轉種於鹼性平板作分離培養,取可疑菌落作玻片凝集,陽性者再作生化反應及生物型別鑑定試驗。

特異性制動試驗

取檢材或新鮮鹼性蛋白腖水培養物一滴,置於載玻片上,再加霍亂弧菌多價診斷血清,加蓋玻片,用暗視野鏡觀察,3分鐘內運動被抑制的即為陽性,此法優點是快速而特異操作簡便,但必須有數量較多的弧菌才檢出。

免疫螢光試驗

除一般免疫螢光法外,還可用螢光菌球法檢查。

特徵

霍亂弧菌所致的霍亂,為烈性腸道傳染病,曾在世界上發生過幾次大流行,至今仍未平息,因此,霍亂被列為國境檢疫的傳染病。
霍亂弧菌有兩個生物型,一為古典生物型,一為愛爾托生物型,這兩個生物型在形態及血清學性狀方面幾乎相同,可作第四組霍亂噬菌體裂解試驗,多粘菌素B敏感試驗,雞紅細胞凝集試驗,V-P(服-潑)二氏試驗等試驗加以鑑別:
本菌是需氧菌,營養要求不高,在普通培養基上生長良好。霍亂弧菌具有耐鹼性,故常用鹼性(pH值8.4~9.2)培養基選擇性分離培養本菌。在鹼性瓊脂平板上生長後,呈水滴樣光滑型菌落,而在鹼性蛋白腖液體培養基中,生長迅速,培養6~8小時即可形成菌膜,利用這一特點,可以作快速增菌,進行鑑定。在慶大黴素瓊脂平板上,生長快,8~10小時能生長出小菌落,可供鑑定用。霍亂弧菌能分解蔗糖、甘露醇,產酸不產氣,不能分解阿拉伯膠糖。
霍亂弧菌
霍亂弧菌在未經處理的糞便中,可存活數天;在冰櫃內的牛奶、鮮肉和魚蝦水產品中存活時間分別為2~4周、1周和1~3周;在室溫下存放的新鮮蔬菜中,可存活1~5天;在砧板和布上可存活相當長時間;在玻璃、瓷器、塑膠和金屬上存活時間不超過2天。霍亂弧菌古典生物型在外界環境中生存能力不強,而愛爾托生物型抵抗力較強,在河水、井水、池塘水和海水中可存活1~3周,甚至更長,有時在局部自然水中也能越冬。愛爾托生物型弧菌可粘附于海洋甲殼類生物表面,分泌甲殼酶,分解甲殼作為營養而長期存活,如愛爾托生物型弧菌被人工飼養的泥鰍、鱔魚吞食後,可在其體內生長繁殖,然後排入水中。
霍亂弧菌對熱、乾燥、日光及一般消毒劑均很敏感,經乾燥2小時或加熱55℃10分鐘即可死亡,煮沸立即死亡;對酸敏感,在正常胃酸中僅能存活4分鐘,接觸1∶5000~1∶10000鹽酸或硫酸、1∶2000~1∶3000升汞或1∶500000高錳酸鉀,數分鐘即被殺滅,在0.1%漂白粉中10分鐘內即可死亡。氯化鈉的濃度高於4%或蔗糖濃度在5%以上的食物、香料、醋及酒等,均不利於霍亂弧菌的生存。

發病機制

正常胃酸可殺滅霍亂弧菌,當胃酸分泌缺乏或低下,或入侵的霍亂弧菌數量較多,未被殺滅的弧菌就進入小腸,在鹼性腸液內迅速繁殖,並通過粘液對細菌的趨化吸引作用、細菌鞭毛活動及弧菌粘蛋白溶解酶和粘附素等的作用,粘附於小腸黏膜的上皮細胞表面,並在此大量繁殖。
此菌產生強烈的外毒素,即霍亂腸毒素,由A亞單位和B亞單位組成。B亞單位與該處黏膜上皮細胞表面受體——神經節苷脂結合,A、B兩種亞單位解離,A亞單位穿過細胞膜進入細胞內,激活腺苷酸環化酶(AC),使細胞內三磷酸腺苷(ATP)轉化為環磷酸腺苷(cAMP),使細胞內環磷酸腺苷含量提高,促使一系列酶反應加速進行,導致空腸到迴腸部腺細胞分泌功能亢進,引起大量液體及血漿中的鈉、鉀、氯等離子進入腸腔,由於分泌功能超過腸道再吸收能力,從而造成嚴重的腹瀉及嘔吐;由於膽汁分泌減少,且腸腔中有大量水、粘液及電解質,故排瀉物呈白色“米泔水”樣;由於劇烈吐瀉,導致脫水和電解質丟失,引起缺鉀、缺鈉及肌肉痙攣;由於碳酸氫根離子丟失,酸性代謝物在體內蓄積,引起代謝性酸中毒;由於有效血容量急劇減少,血液濃縮,導致尿量減少、血壓下降,甚至休克;由於腎缺血、缺氧,細胞內缺鉀,導致腎小管上皮細胞變性、壞死,造成急性腎功能衰竭
霍亂弧菌
主要病變均由嚴重脫水引起,臨床可見指紋皺縮,皮下組織及肌肉干癟。心、肝、脾等臟器均見縮小。內臟漿膜無光澤。腸腔高度擴張、腸內充滿泔水樣液體,腸黏膜鬆弛,但黏膜上皮完整,無潰瘍。膽囊內充滿粘稠膽汁。腎小球及間質的毛細管擴張,腎小管腫脹、變性及壞死。其他臟器也有出血、變性等變化。

防治原則

必須貫徹預防為主的方針,作好對外交往及入口的檢疫工作,嚴防本菌傳入,此外應加強水、糞管理,注意飲食衛生。對病人要嚴格隔離,必要時實行疫區封鎖,以免疾病擴散蔓延。
人群的菌苗預防接種,可獲良好效果,現用加熱或化學藥品殺死的古典型霍亂菌苗皮下接種,能降低發病率。這種苗菌對EL-Tor型霍亂弧菌感染也有保護作用,但持續時間短,僅3-6個月。目前有新型的口服rBS/WC疫苗(重組B亞單位/霍亂菌體疫苗)可用於預防霍亂,2000年WHO關於霍亂疫苗的意見書提出,“應考慮對有罹患霍亂危險性的人群使用rBS/WC疫苗”。該疫苗對霍亂的保護期為3年,國內有上海聯合賽爾生物工程有限公司生產rBS/WC疫苗。 
治療主要為及時補充液體和電解質及套用抗菌藥物如鏈黴素氯黴素強力黴素、複方SMZ-TMP等。

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