基本介紹
- 中文名：酵母雙雜交系統
- 外文名：Yeast two hybrid
- 提出者：Fields和Song
- 提出時間：1989年
- 特點：快速直接
- 新功能：發現新基因
- 遇到問題：假陽性較多、轉化效率偏低
基本思想,基本原理,發展,文庫篩選,結構組成,套用,特點,局限性,常見問題,最佳化,改進版本,反向系統,發展前景,
基本思想
酵母雙雜交由Fields和Song在1989年提出. 他的產生是基於對真核細胞轉錄因子特別是酵母轉錄因子GAL4性質的研究. GAL4包括兩個彼此分離的但功能必需的結構域. 位於N端1-147位胺基酸殘基區段的DNA結合域（DNA binding domain，DNA-BD）和位於C端768-881 位胺基酸殘基區段的轉錄激活域（Activation domain,AD).DNA-BD能夠識別位於GAL4效應基因（GAL4-responsivegene）的上游激活序列(Upstream activating sequence,UAS)，並與之結合. 而AD則是通過與轉錄機構（transcriptionmachinery）中的其他成分之間的結合作用，以啟動UAS下游的基因進行轉錄. DNA-BD和AD單獨分別作用並不能激活轉錄反應，但是當二者在空間上充分接近時，則呈現完整的GAL4轉錄因子活性並可激活UAS下游啟動子，使啟動子下游基因得到轉錄.
酵母雙雜交模型
酵母雙雜交模型Fields建立了一個雙雜交系統，BD與X蛋白融合，AD與Y蛋白融合，如果X、Y之間形成蛋白-蛋白複合物，使GAL4兩個結構域重新構成，則會啟動特異基因序列的轉錄. 他們利用Snf1與Snf4的相互作用， 將Snf1與BD融合，Snf4與AD融合，構建在穿梭質粒上. 其中Snf1是一種依賴於絲氨酸、蘇氨酸的蛋白激酶，Snf4是他的一個結合蛋白. 研究者將二種穿梭質粒轉化酵母GGY：171 菌株，該菌株含有LacZ報告基因，並已去除相應轉錄因子基因. 該實驗的結果表明由Snf1和Snf4相互作用使得AD和BD在空間上接近，激活了報告基因LacZ的轉錄. 一般地，將BD-X的融合蛋白稱作誘餌（bait),X往往是已知蛋白，AD-Y稱作獵物（prey），能顯示誘餌和獵物相互作用的基因稱報告基因，通過對報告基因的檢測，反過來可判斷誘餌和獵物之間是否存在相互作用.
基本原理
雙雜交系統的建立得力於對真核生物調控轉錄起始過程的認識。細胞起始基因轉錄需要有反式轉錄激活因子的參與。80年代的工作表明，轉錄激活因子在結構上是組件式的（modular）, 即這些因子往往由兩個或兩個以上相互獨立的結構域構成, 其中有DNA結合結構域（DNA binding domain，簡稱為BD）和轉錄激活結構域（activation domain，簡稱為AD），它們是轉錄激活因子發揮功能所必需的。前者可識別DNA上的特異序列，並使轉錄激活結構域定位於所調節的基因的上游，轉錄激活結構域可同轉錄複合體的其他成分作用，啟動它所調節的基因的轉錄。兩個結構域不但可在其連線區適當部位打開， 仍具有各自的功能。而且不同兩結構域可重建發揮轉錄激活作用。酵母雙雜交系統利用雜交基因通過激活報導基因的表達探測蛋白－蛋白的相互作用。單獨的BD雖然能和啟動子結合，但是不能激活轉錄。而不同轉錄激活因子的BD和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉錄的功能。如酵母細胞的Gal4蛋白的BD與大腸桿菌的一個酸性激活結構域B42融合得到的雜合蛋白仍然可結合到Gal4結合位點並激活轉錄。主要有二類載體： a 含DNA -binding domain的載體； b 含DNA-activating domain的載體。一般編碼一個蛋白的基因融合到明確的轉錄調控因子的DNA－結合結構域(如GAL4-bd， LexA-bd）； 另一個蛋白的基因融合到轉錄激活結構域（如GAL4-ad， VP16）。上述二類載體在構建融合基因時， 測試蛋白基因與結構域基因必須在閱讀框內融合。融合基因在報告株中表達， 其表達產物只有定位於核內才能驅動報告基因的轉錄。例如GAL4-bd具有核定位序列（nuclear-localization sequence）， 而GAL4-ad沒有。因此， 在GAL4-ad氨基端或羧基端應克隆來自SV40的T-抗原的一段序列作為核定位的序列。目前研究中常用binding-domain基因有：GAL4（1-147）; LexA (E coli轉錄抑制因子）的DNA-bd編碼序列。常用的activating-domain基因有：GAL4（768-881）和皰疹病毒VP16的編碼序列等。
利用酵母雙雜交篩選基因
利用酵母雙雜交篩選基因雙雜交系統的另一個重要的元件是報導株。報導株指經改造的、含報導基因（reporter gene）的重組質粒的宿主細胞。最常用的是酵母細胞， 酵母細胞作為報導株的酵母雙雜交系統具有許多優點： 〈1〉 易於轉化、便於回收擴增質粒。〈2〉具有可直接進行選擇的標記基因和特徵性報導基因。〈3〉酵母的內源性蛋白不易同來源於哺乳動物的蛋白結合。激活結構域融合基因轉入表達結合結構域融合基因的酵母細胞系中， 蛋白間的作用使得轉錄因子重建導致相鄰的報導基因表達（如lacZ）， 從而可分析蛋白間的結合作用。
酵母雙雜交系統能在體內測定蛋白質的結合作用， 具有高度敏感性。主要是由於：①採用高拷貝和強啟動子的表達載體使雜合蛋白過量表達。②信號測定是在自然平衡濃度條件下進行， 而如免疫共沉澱等物理方法為達到此條件需進行多次洗滌，降低了信號強度。③雜交蛋白間穩定度可被激活結構域和結合結構域結合形成轉錄起始複合物而增強， 後者又與啟動子DNA結合， 此三元複合體使其中各組分的結合趨於穩定。④通過mRNA產生多種穩定的酶使信號放大。同時， 酵母表型， X-Gal及HIS3蛋白表達等檢測方法均很敏感。
發展
隨著對多種重要生物的大規模基因組測序工作的完成，基因工程領域又迎來了一個新的時代---功能基因組時代。它的任務就是對基因組中包含的全部基因的功能加以認識。生物體系的運作與蛋白質之間的互相作用密不可分，例如：DNA合成、基因轉錄激活、蛋白質翻譯、修飾和定位以及信息傳導等重要的生物過程均涉及到蛋白質複合體的作用。能夠發現和驗證在生物體中相互作用的蛋白質與核酸、蛋白質與蛋白質是認識它們生物學功能的第一步。
酵母雙雜交技術作為發現和研究在活細胞體內的蛋白質與蛋白質之間的相互作用的技術平台，在近幾年來得到了廣泛運用。酵母雙雜交系統是在真核模式生物酵母中進行的，研究活細胞內蛋白質相互作用，對蛋白質之間微弱的、瞬間的作用也能夠通過報告基因的表達產物敏感地檢測得到，它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質之間關係的技術。大量的研究文獻表明，酵母雙雜交技術既可以用來研究哺乳動物基因組編碼的蛋白質之間的互作，也可以用來研究高等植物基因組編碼的蛋白質之間的互作。因此，它在許多的研究領域中有著廣泛的套用。本文就酵母雙雜交的技術平台和套用加以介紹。
酵母雙雜交的步驟
酵母雙雜交的步驟酵母雙雜交系統的建立是基於對真核生物調控轉錄起始過程的認識。細胞起始基因轉錄需要有反式轉錄激活因子的參與。反式轉錄激活因子，例如酵母轉錄因子GAL4在結構上是組件式的（modular），往往由兩個或兩個以上結構上可以分開，功能上相互獨立的結構域（domain）構成，其中有DNA結合功能域（DNA binding domain,DNA-BD）和轉錄激活結構域（activation domain，DNA-AD）。這兩個結合域將它們分開時仍分別具有功能，但不能激活轉錄，只有當被分開的兩者通過適當的途徑在空間上較為接近時，才能重新呈現完整的GAL4轉錄因子活性，並可激活上游激活序列（upstream activating sequence,UAS）的下游啟動子，使啟動子下游基因得到轉錄。
根據這個特性，將編碼DNA-BD的基因與已知蛋白質Bait protein的基因構建在同一個表達載體上，在酵母中表達兩者的融合蛋白BD-Bait protein。將編碼AD的基因和cDNA文庫的基因構建在AD-LIBRARY表達載體上。同時將上述兩種載體轉化改造後的酵母，這種改造後的酵母細胞的基因組中既不能產生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏這些營養的培養基上無法正常生長。當上述兩種載體所表達的融合蛋白能夠相互作用時，功能重建的反式作用因子能夠激活酵母基因組中的報告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，從而通過功能互補和顯色反應篩選到陽性菌落。將陽性反應的酵母菌株中的AD-LIBRARY載體提取分離出來，從而對載體中插入的文庫基因進行測序和分析工作。在酵母雙雜交的基礎上，又發展出了酵母單雜交、酵母三雜交和酵母的反向雜交技術。它們被分別用於核酸和文庫蛋白之間的研究、三種不同蛋白之間的互作研究和兩種蛋白相互作用的結構和位點。
文庫篩選
酵母雙雜交的文庫篩選通過報告基因的功能篩選相互作用的蛋白，從酵母中分離質粒然後轉化E. coli ，從大腸桿菌中提取質粒並測序 ，在資料庫中比對所測定序列與已知蛋白的同源性。
結構組成
酵母雙雜交系統可套用於確定兩已知有生理作用的蛋白間的作用位點或結構域。利用此系統已分析和測定了多種重要結構域， 如p85三磷酸肌醇激酶和p110亞單位作用的結構域v， p21cip1蛋白與增殖細胞核抗原(proliferating-cell nuclear antigen， PCNA) 的結合序列vi等。
此外酵母雙雜交系統還套用於闡明蛋白質相互作用的結構域，繪製蛋白質聯繫圖譜，在藥物設計等許多方面。
套用
酵母雙雜交系統是在真核模式生物酵母中進行的，研究活細胞內蛋白質相互作用，對蛋白質之間微弱的、瞬間的作用也能夠通過報告基因的表達產物敏感地檢測得到，它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質之間關係的技術。大量的研究文獻表明，酵母雙雜交技術既可以用來研究哺乳動物基因組編碼的蛋白質之間的互作，也可以用來研究高等植物基因組編碼的蛋白質之間的互作。因此，它在許多的研究領域中有著廣泛的套用。
發現新的蛋白質和蛋白質的新功能
酵母雙雜交技術已經成為發現新基因的主要途徑。當我們將已知基因作為誘餌，在選定的cDNA文庫中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽性酵母菌株中可以分離得到AD-LIBRARY載體，並從載體中進一步克隆得到隨機插入的cDNA片段，並對該片段的編碼序列在GENBANK中進行比較，研究與已知基因在生物學功能上的聯繫。另外，也可作為研究已知基因的新功能或多個篩選到的已知基因之間功能相關的主要方法。例如：Engelender等人以神經末端蛋白alpha-synuclein 蛋白為誘餌蛋白，利用酵母雙雜交CLONTECH MATCHMARKER SYSTEM 3為操作平台，從成人腦cDNA文庫中發現了與alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1，並證明了Synphilin-1與alpha-synuclein 之間的相互作用與帕金森病的發病有密切相關。為了研究兩個蛋白之間的相互作用的結合位點，找到影響或抑制兩個蛋白相互作用的因素，Michael等人又利用酵母雙雜交技術和基因修飾證明了alpha-synuclein的1-65個胺基酸殘基和Synphilin-1的349-555個胺基酸殘基之間是相互作用的位點。研究它們之間的相互作用位點有利於基因治療藥物的開發。
在細胞體內研究抗原和抗體的相互作用
利用酶聯免疫（ELISA）、免疫共沉澱（CO-IP）技術都是利用抗原和抗體間的免疫反應，可以研究抗原和抗體之間的相互作用，但是，它們都是基於體外非細胞的環境中研究蛋白質與蛋白質的相互作用。而在細胞體內的抗原和抗體的聚積反應則可以通過酵母雙雜交進行檢測。例如：來源於矮牽牛的黃烷酮醇還原酶DFR與其抗體scFv的反應中，抗體的單鏈的三個可變區A4、G4、H3與抗原之間作用有強弱的差異。Geert等利用酵母雙雜交技術，將DFR作為誘餌蛋白，編碼抗體的三個可變區的基因分別被克隆在AD-LIBRARY載體上，將BD-BAIT載體和每種AD-LIBRARY載體分別轉化改造後的酵母菌株中，並檢測報告基因在克隆的菌落中的表達活性，從而在活細胞的水平上檢測抗原和抗體的免疫反應。
篩選藥物作用位點及藥物對蛋白相互作用影響
酵母雙雜交的報告基因能否表達在於誘餌蛋白與靶蛋白之間的相互作用。對於能夠引發疾病反應的蛋白互作可以採取藥物干擾的方法，阻止它們的相互作用以達到治療疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黃熱病、肝炎等疾病，研究發現它的病毒RNA複製與依賴於RNA的RNA聚合酶（NS5）與拓撲異構酶NS3，以及細胞核轉運受體BETA-importin的相互作用有關。研究人員通過酵母雙雜交技術找到了這些蛋白之間相互作用的胺基酸序列。如果能找到相應的基因藥物阻斷這些蛋白之間的相互作用，就可以阻止RNA病毒的複製，從而達到治療這種疾病的目的。
建立基因組蛋白連鎖圖
眾多的蛋白質之間在許多重要的生命活動中都是彼此協調和控制的。基因組中的編碼蛋白質的基因之間存在著功能上的聯繫。通過基因組的測序和序列分析發現了很多新的基因和EST序列，HUA等人利用酵母雙雜交技術，將所有已知基因和EST序列為誘餌，在表達文庫中篩選與誘餌相互作用的蛋白，從而找到基因之間的聯繫，建立基因組蛋白連鎖圖。對於認識一些重要的生命活動：如信號傳導、代謝途徑等有重要意義。
特點
酵母雙雜交系統的最主要的套用是快速、直接分析已知蛋白之間的相互作用及分離新的與已知蛋白作用的配體及其編碼基因。酵母雙雜交系統檢測蛋白之間的相互作用具有以下優點： ⑴ 作用信號是在融合基因表達後， 在細胞內重建轉錄因子的作用而給出的， 省去了純化蛋白質的繁瑣步驟。⑵ 檢測在活細胞內進行， 可以在一定程度上代表細胞內的真實情況。⑶ 檢測的結果可以是基因表達產物的積累效應， 因而可檢測存在於蛋白質之間的微弱的或暫時的相互作用。⑷酵母雙雜交系統可採用不同組織、器官、細胞類型和分化時期材料構建cDNA文庫， 能分析細胞漿、細胞核及膜結合蛋白等多種不同亞細胞部位及功能的蛋白。例如已報導成功分析了RAP1與RIF1ii、P21cip1與CDK2iii、p16與CDK4iv等之間的相互作用。
局限性
酵母雙雜交系統是分析蛋白-蛋白間相互作用的有效和快速的方法， 有多方面的套用， 但仍存在一些局限性。⑴雙雜交系統分析蛋白間的相互作用定位於細胞核內， 而許多蛋白間的相互作用依賴於翻譯後加工如糖基化、二硫鍵形成等， 這些反應在核內無法進行。另外有些蛋白的正確摺疊和功能有賴於其他非酵母蛋白的輔助， 這限制了某些細胞外蛋白和細胞膜受體蛋白等的研究。⑵酵母雙雜交系統的一個重要的問題是"假陽性"。由於某些蛋白本身具有激活轉錄功能或在酵母中表達時發揮轉錄激活作用， 使DNA結合結構域雜交蛋白在無特異激活結構域的情況下可激活轉錄。另外某些蛋白表面含有對多種蛋白質的低親和力區域， 能與其他蛋白形成穩定的複合物， 從而引起報告基因的表達， 產生"假陽性"結果。
許多研究者對雙雜交系統進行了改進和發展，。例如採用假陽性顯示分析法和雙篩選系統以減少"假陽性"的發生；發展哺乳動物雙雜交系統更好地研究蛋白間的相互作用。其中雙篩選系統用二種不同的報告基因（常用lacZ和HIS3）有以下優勢vii：⑴ 用不同的啟動子表達位於酵母二個染色體上的報告基因， 可明顯減少假陽性。⑵ 通過營養型篩選增強了篩選能力， 尤其適用於對較大的庫容量而被選蛋白較少情況下的篩選。
哺乳動物雙雜交系統Ⅷ也是一種基因水平上以重建轉錄因子功能為基礎的體內分析方法。在此系統中，一種感興趣的蛋白與Gal4--DNA結合結構域構成融合蛋白，另一種蛋白與單純皰疹病毒VP16蛋白的激活結構域以融合蛋白表達。表達這些融合蛋白的載體與一個報導載體（CAT）共同轉染哺乳動物細胞系。報導質粒含一個Gal4結合位點下游的cat基因。假如兩個融合蛋白相互作用則cat報導基因表達水平明顯增高。用此系統證實了P53蛋白與大T抗原的相互作用， 得到了酵母雙雜交系統相同的結果。且較酵母雙雜交系統更為快速，在轉染48h內得到結果。並且在哺乳動物細胞能更好模仿體內的蛋白-蛋白相互作用。因而，哺乳動物雙雜交系統可作為酵母雙雜交系統的輔助手段。
常見問題
酵母雙雜交系統套用中常遇到的問題一是假陽性較多，二是轉化效率偏低。所謂假陽性就是：在待研究的兩個蛋白間沒有發生相互作用的情況下，報告基因被激活。主要原因是由於BD融合誘餌蛋白有單獨激活作用，或者這種融合蛋白的激活作用被外來蛋白激活。另外AD融合靶蛋白如果有DNA的特異性結合，則也可單獨激活報告基因的表達。因此，為排除假陽性就需要作嚴格的對照試驗。應對誘餌和靶蛋白分別作單獨激活報告基因的鑑定。目前幾個公司推出的酵母雙雜系統都採用了多個報告基因，且每個報告基因的上游調控區各不相同，這可減少大量的假陽性。另外，報告基因通常整合到染色體上，可以使基因表達水平穩定，消除了由於質粒拷貝數變化引起基因表達水平波動而造成的假陽性。即使根據嚴格的對照實驗證明確實發生了蛋白間的相互作用，還應對以下方面進行分析：
（1）這種相互作用是否會在細胞內自然發生，即這一對蛋白在細胞的正常生命活動中是否會在同一時間表達且定位在同一區域。
（3）一些實際上沒有任何相互作用的但有相同的模體（motif）如兩個親a-螺旋的蛋白質間可以發生相互作用。十年來，酵母雙雜交技術一直在消除假陽性方面不斷改進，並且已取得較好的效果〔2，3〕。
在酵母雙雜交的套用中有時也會遇到假陰性現象。所謂假陰性，即兩個蛋白本應發生相互作用，但報告基因不表達或表達程度甚低以至於檢測不出來〔4〕。造成假陰性的原因主要有兩 方面：一是融合蛋白的表達對細胞有毒性。這時應該選擇敏感性低的菌株或拷貝數低的載體。二是蛋白間的相互作用較弱，應選擇高敏感的菌株及多拷貝載體。目前假陰性現象雖不是實驗中的主要問題，但也應予以重視。
轉化效率是酵母雙雜交文庫篩選時成敗的關鍵之一，特別是對低豐度cDNA庫進行篩選時，必須提高轉化效率。轉化時可採用共轉化或依次轉化，相比之下共轉化省時省力。更重要的是如果單獨轉化會發生融合表達蛋白對酵母細胞的毒性時，共轉化則可以減弱或消除這種毒性。一種更有效的方法是將誘餌蛋白載體與靶蛋白載體分別轉入不同接合型的單倍體酵母中，通過兩種接合型單倍體細胞的雜交將誘餌蛋白與靶蛋白帶入同一個二倍體細胞。
目前很多機構建立了大量的cDNA文庫和基因組文庫，但這些文庫大多無法直接用於雙雜交系統的篩選。而文庫的質量對於轉化和篩選又非常關鍵。因此，大量構建適用於酵母雙雜交的文庫非常必要。現已出現一種採用體內重組技術來達到這個目的的方法〔5〕。
最佳化
在雙雜交鑑定過程中要經過兩次轉化，這個工作量是相當大的，特別是尋找新的作用蛋白質的時候尤其如此。而且，酵母細胞的轉化效率比細菌要低約4個數量級。因此轉化步驟就成為雙雜交技術的瓶頸。Bendixen等人通過酵母接合型的引用，避免了兩次轉化操作，同時又提高了雙雜交的效率。在酵母的有性生殖過程中涉及到兩種配合類型：a接合型和α接合型，這兩種單倍體之間接合（mating）能形成二倍體，但a接合型細胞之間或α接合型細胞之間不能接合形成二倍體。根據酵母有性生殖的這一特點，他們將文庫質粒轉化α接合型酵母細胞，“誘餌”表達載體轉化a接合型細胞。然後分別鋪篩選平板使細胞長成菌苔（lawn），再將兩種菌苔複印到同一個三重篩選平板上，原則上只有誘餌和靶蛋白發生了相互作用的二倍體細胞才能在此平板上生長。單倍體細胞或雖然是二倍體細胞但DB融合蛋白和AD融合蛋白不相互作用的都被淘汰。長出來的克隆進一步通過β-半乳糖苷酶活力進行鑑定。這項改進不僅簡化了實驗操作，而且也提高了雙雜交的篩選效率。
Vidal等人發展了所謂的逆雙雜交系統（reverse two-hybrid system）。這項技術的關鍵是報導基因URA3的引入。URA3基因在這裡起到了反選擇的作用, 它編碼的酶是尿嘧啶合成的關鍵酶。該酶能把5-氟乳清酸(5-FOA)轉化成對細胞有毒的物質。Vidal等人通過改造在URA3基因的啟動子內引入Gal4的結合位點。這個改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的選擇性培養基上只有當“誘餌”和“獵物”相互作用激活URA3基因的表達才能生長。在含有5-FOA的完全培養基上“誘餌”和“獵物”的相互作用則抑制細胞的生長。然而如果目的蛋白，即與DB或AD融合的蛋白質發生了突變或者由於外加藥物的干擾不再相互作用，URA3基因不表達，則細胞能在含有5-FOA的完全培養基上生長。通過這種方法，Vidal等人篩選到了轉錄因子E2F1的突變物，這些突變物仍然能結合視網膜母細胞瘤蛋白RB，但是喪失了同另外一種稱為DP1蛋白的結合能力。結果得到了體外結合實驗的驗證。通過對這些突變蛋白基因的測序，他們發現了新的E2F1同DP1結合的位點。
在某些情況下，在液體培養基中培養不好的菌珠可以在固體培養基上生長得很好。如果誘餌蛋白對酵母細胞是有毒的，可以通過基因重組切掉轉錄激活域，然後重新檢測其是否自激活，但要注意重組也有可能破壞蛋白之間的互作。一個甚至兩個融合蛋白對酵母細胞有毒。你可以通過重組方法來減輕毒性，同時又能保證蛋白的相互作用。或者使用表達水平較低的載體。也可以在瓊脂平板或濾膜上進行雜交。但同時必須作雜交對照實驗。酵母雙雜交實驗轉化效率太低，可以採用以下方法解決：
1) 檢測一下DNA的純度，如果可以的話，重新用乙醇純化。
2) DNA-BD/誘餌蛋白很可能是有毒的。
3) 不適當的培養基，重新配製培養基，並做對照轉化。
4) 檢測pGBT9對照載體的轉化效率，放置於SD/–Trp平板上，轉化效率應該在1 x 105 colonies/mg DNA以上。
改進版本
反式轉錄因子抑制（RTA）系統與經典的Y2H相反，誘餌-獵物的互作將抑制轉錄因子激活報告基因。誘餌蛋白X與Gal4的DBD融合後具有轉錄因子的激活活性，另一個蛋白Y與一種轉錄阻礙物（Tup1p）的抑制結構域（RD）融合。如果兩者可以相互作用，報告基因的轉錄就會被抑制[60]。RTA系統已被用於研究哺乳動物basic helix-loop-helix proteins MyoD和E12、protooncogenic transcription factor c-Myc與the putative tumor suppressor protein Bin1蛋白間的相互作用。同時，該系統還被用於篩選與各種轉錄激活因子的相互作用，如單純性皰疹病毒（HSV-1）調控蛋白VP16 [60]，c-Myc及雄性激素受體。
SOS和RAS募集系統 (SRS and RRS)是Ras信號通路轉錄的旁路（are bypassing the transcriptional readout by using the Ras signalling pathway），在酵母細胞和哺乳動物中是相似的。Ras被定位在質膜上，可通過酵母中的Cdc25或哺乳動物中的Son of sevenless (SOS)脒基交換因子進行GDP-GTP的轉換。Ras被激活後會引發下游信號轉導途徑。此處描述的Y2H系統使用Cdc25-2溫度敏感型酵母菌株，因為Cdc25-2沒有活性，不能激活Ras信號轉導途徑，導致此菌株在高溫（36 ℃）下不能生長。通過Y2H系統中選擇性激活Ras，可以使其溫度敏感表型消失。
SCINEX-P系統（胞外蛋白間的互作篩選）由Urech等於2003年發布，使我們可以分析ER內的氧化環境中的蛋白互作。該系統利用酵母未摺疊蛋白反應（UPR）的信號途徑。ER中錯誤摺疊蛋白的積累會誘導酵母ER I類跨膜蛋白（Ire1p）形成二聚體，後者誘導Hac1p轉錄，其產物可激活分子伴侶的轉錄。在SCINEX-P系統中，目的蛋白與缺少位於腔內的N末端寡聚化結構域的Ire1p突變蛋白（ΔIre1p）融合。兩種雜合蛋白的互作會引起Ire1p蛋白二聚體的重構，從而激活UPR下游信號轉導過程。為了檢測蛋白互作，Hac1p UPR元件被引入報告基因的啟動子上。此Y2H系統被成功地用於分析蛋白質二硫鍵異構酶ERp57與鈣聯蛋白間（這兩個蛋白都在ER中摺疊）、抗原與抗體間的互作。
膜反式轉錄激活因子分裂泛素(MbY2H)系統使用人工轉錄因子（LexA-VP16）作為與泛素相連可被水解的報告蛋白，可分析ER膜蛋白間的相互作用。一旦泛素被重組，LexA-VP16就被釋放到核中並激活報告基因的轉錄（如HIS3，LacZ）。這種轉錄激活方式放大了蛋白的互作反應，對瞬時互作的檢更敏感、更方便。此系統已被成功用於檢測不同種類膜蛋白間的互作反應。分裂泛素系統已被廣泛套用於cDNA文庫篩選和大規模矩陣法中。
近期，改進後適用於胞質蛋白互作篩選的MbY2H系統已被發布。在此改進方案中，誘餌載體上包括Cub和轉錄因子，並且由於融合了ER膜蛋白Ost4p，使此融合蛋白錨定在ER膜上。
反向系統
反向酵母雙雜交系統
確定了蛋白之間的相互作用後，更重要的工作是研究其功能、結構及其作用的條件調節。鑑定在相互作用的一對蛋白中的任一蛋白突變對其相互作用的抑制作用，不僅有助於探索相互作用的結構單位，而且可作為研究體內功能的遺傳學方法。這對於多個作用分子的蛋白就更為重要。1996年Vidalix x等建立了反向酵母雙雜交系統(reverse two-hybrid system)，提供了簡便的鑑定阻斷蛋白間相互作用的方法。反向酵母雙雜交系統的關鍵是摻入一種表達產物對細胞生長有毒的報導基因，用於監測蛋白間的相互作用。例如酵母URA3基因表達產物是尿嘧啶合成所必需的，同時它又可催化5-氟乳清酸(5-FOA)轉化為有毒物質。Vidal等構建了一酵母細胞株，其URA3的表達由含GAL4結合位點的啟動子嚴密控制。此細胞株在缺乏尿嘧啶的培養基中培育需要GAL4激活結構域(GAD)和GAL4 DNA結合結構域(GBD)的融合蛋白的相互作用的表達。而在含5-FOA的完全培養基中則受GAD和GBD融合蛋白相互作用的抑制。因此可通過篩選5-FOA抗性克隆從隨機突變庫中鑑定阻斷蛋白相互作用的突變體。
反向雙雜交系統可更有效地蛋白間作用的關鍵位點或起決定作用的個別胺基酸，進而分析蛋白結構和功能的關係。此外此系統還可篩選能阻止某些蛋白間相互作用的肽或小分子物質用作臨床治療製劑。
發展前景
在後基因組時代更具意義且更能發揮酵母雙雜交技術的領域是研究生命活動中的網路調節〔18〕。第一個具有開拓性的工作是Bartel利用酵母雙雜交技術建立了一個T7-噬菌體的網路調節圖（linkage-map）〔19〕。Fromont-Racine等對篩選到的陽性克隆進行鑑定測序，並將它們分為5類，然後對其中的四類（非編碼序列除外）通過15輪的篩選與分析，繪製出一張綜合了酵母蛋白相互作用的全局性信息圖〔20〕。這是以往的實驗所難以獲得的。
為適應功能基因網路調控研究的需要，CLONTECH公司在Merck-Washington大學的EST項目研究成果基礎上，採用了與傳統建庫方式完全不同的細胞內同源重組方法，以高通量規模構建了一種陣列模式的酵母雙雜交cDNA文庫。它主要有以下特點：
（1）來源於多種組織器官和細胞系，因此含有幾乎所有基因的cDNA；
（2）所含各種cDNA的豐度趨於平衡；
（3）含有較長的插入序列，但不是全長cDNA序列。
