酶分子定向進化是近幾年發展起來的一種蛋白質工程的新策略，可以在未知目標蛋白三維結構信息和作用機制的情況下，在體外模擬進化過程(編碼基因的隨機突變、重組和定向篩選)，獲得具有改進功能或全新功能的酶即進化酶，用幾天或幾周的時間實現幾百萬年的自然進化過程，因而是發現新的生物活性分子和反應途徑的重要方法，已在短短几年內取得了令人矚目的成就。
基本介紹
- 中文名：進化酶
- 外文名：evolutional enzyme
- 目的：酶分子定向進化
- 結果：具有改進功能或全新功能的酶
- 類型：分子水平的定向進化
- 實質：達爾文進化論基礎上發展
簡介,酶分子定向進化原理,定向進化策略,易錯PCR,DNA改組,外顯子的改組,定向進化的套用,
簡介
自然界所有複雜的生物都是通過自然進化而來的，並相對獨立地存在。酶則是生命活動按照預定方向進行的根本保證。科學家們在不斷發現自然界中新酶的同時，試圖對天然酶分子進行改造。近年來，隨著基因工程技術的快速發展，易錯PCR、DNA shuffling等突變技術的套用，建立了改造天然酶分子和構建新酶的有效方法——酶分子體外定向進化技術(directed evolution of enzyme in vitro)。在實驗室條件下模擬自然界幾十億年的漫長進化過程，讓目標酶分子在事先設計的道路上快速“進化”，從而產生具備多種有益特性的酶分子。這種採用酶分子定向進化技術，通過人為地創造特殊的條件，模擬自然進化機制(隨機突變、重組和自然選擇)，在體外改造酶基因，並定向選擇所需性質的突變體製備的酶稱為進化酶。
酶分子定向進化原理
酶分子的定向進化是從一個或多個已經存在的親本酶(天然的或人為獲得的)出發，經過基因的突變和重組，構建一個人工突變酶庫，通過篩選最終獲得預先期望的具有某些特性的進化酶。通常採用PCR技術擴增待進化的酶基因，利用Taq DNA聚合酶沒有3’—5‘校對功能的特性，控制擴增條件，使產物中引入隨機突變，從而獲得突變基因庫。然後通過定向選擇法，篩選出所需性質最佳化的酶。簡言之，定向進化=隨機突變+定向選擇。定向選擇是關鍵，策略和方法靈活多樣，根據目的制定。定向進化的基本策略與自然進化十分相似。不同之處在於自然進化是環境作用引發突變，其進化歷程十分漫長；而定向進化完全是人為引發突變，人為控制酶分子朝著人們期望的特定目標進化。定向進化歷程可大為縮短(數年、數月甚至數天)。
定向進化策略
易錯PCR
易錯PCR是利用低保真度Taq DNA聚合酶或改變PCR反應條件(包括提高鎂離子濃度、加入錳離子、改變dNTP濃度等)，增加Taq DNA聚合酶突變頻率，引入鹼基錯配，導致目的基因隨機突變。經多輪PCR擴增，連續反覆地進行隨機誘變，使每一次獲得的小突變累積而產生重要的有益突變。如枯草桿菌蛋白酶E在非水相溶液中經第一次定向進化後，得到的突變體PC3在60%和85%的二甲基甲醯胺(DMF)中的催化效率Kcal/Km分別為天然酶的256倍和131倍，比活性提高157倍。再經兩次定向進化後的突變體催化效率比PC3高3倍(60%DMF)，比天然酶高471倍。
DNA改組
DNA改組(DNA shuffling)又稱有性PCR(sexual PCR)，是對一組相關基因用DNaseⅠ或超音波進行切割產生隨機大小的DNA片段，各片段互為模板和引物再進行PCR擴增，直至產生全長的基因。例如頭孢菌素酶的定向進化是將來自4個不同菌種的頭孢菌素酶基因視為一個基因庫，單獨進化的4個基因中每個酶基因對拉氧頭孢抗生素的抗性均提高了8倍左右，而4個基因在一個體系中同時參與改組後，抗性提高了270倍～540倍。進化速率提高了約50倍。最佳突變體含有4個基因中3個基因的8個基因片段，33個突變位點。DNA改組在理論和實踐上都優於連續易錯PCR技術。它不僅可以加速有益突變的積累，而且能使酶的多個最佳化特性聚為一體。
外顯子的改組
由於真核基因的編碼序列通常被內含子間隔分開，轉錄後需要加工剪下內含子、連線外顯子。自然界中，不同的內含子間發生同源重組導致不同外顯子的結合，並組裝成編碼新蛋白的基因，這一過程稱為外顯子改組(exon shuffling)。DNA改組和外顯子改組的相同點是都在各自含突變的片段間進行交換；不同之處是外顯子改組是靠同種分子間內含子的同源性帶動，即是通過內含子介導外顯子重組，而DNA改組發生在整個基因片段上，不受任何限制。Kolkman等於2001年建立了以外顯子為單元進行自由重組的外顯子改組技術，它可以加入更多的理性設計，甚至可以完全避免點突變，因此可套用於醫藥等某些特殊領域。
定向進化的套用
定向進化技術現已廣泛用於酶分子的改造，在提高酶分子的催化活力、酶分子的穩定性以及對環境的適應能力等方面取得了顯著成效。如Joo等從假單孢菌細胞色素P450的定向進化得到的突變體，在無輔助因子存在下，通過“過氧化物途徑”方法可羥基化萘，比天然酶的活性提高20倍。Zhao等利用連續易錯PCR技術結合交錯延伸方法重組DNA，並採用連續提高培養溫度對突變體進行篩選，最終獲得了一株突變體，不僅將枯草桿菌蛋白酶的最適溫度提高了17℃，還使酶在65℃的半衰期增加了200倍。吉林大學酶工程實驗室採用易錯PCR技術對L一天冬氨酸酶進行了改造，經4輪易錯PCR(每輪篩選約3 000個菌落)，最終得到了一株酶活力提高28倍的突變體。研究表明進化酶的pH穩定性和熱穩定性均優於天然酶，因此更適合於工業化生產L一天冬氨酸。運用合理設計與定向進化結合的方法，Fersht等人將α/β桶狀蛋白支架進行胺基酸替換，使吲哚一3一甘油磷酸合成酶(IGPS)活性轉變成磷酸核糖鄰氨基苯甲酸異構酶的活性。運用定向進化技術還可以提高或改變酶的對映體選擇性。最近研究表明：立體選擇性酶的專一性是可以改變的，也就是酶具有柔性。Reetz等的研究表明，來源於銅綠假單胞菌的脂肪酶對於底物P一硝基一苯基一2一甲基癸酸鹽的S構型的選擇性只有2%，但經過4輪易錯PCR突變和篩選之後，它對底物的S構型的選擇性達到81%。
酶分子體外定向進化的突出優點是，不需要事先了解酶的空間結構和催化機制，就可以進行實驗設計(非理性設計)；而化學修飾、定位誘變等，需要對酶的胺基酸序列、空間結構等資料有充分了解，才能設計修飾方案(理性設計)。另一方面，該技術簡便快速、耗資低且有實效。完全在試管中進行的酶的定向進化使在自然界需要幾百萬年的進化過程縮短至幾年、幾個月甚至更短的時間，這無疑是蛋白質工程技術發展的一大飛躍。極大地拓寬了蛋白質工程學的研究和套用範圍。值得注意的是，定向分子進化也稱定向生物技術，並不限於蛋白質類酶，(脫氧)核酶、抗體酶、代謝途徑和細胞等的實驗室進化研究，在近年來都呈現強勁的發展勢頭，將使進化論發展成為一門套用科學。
