蛋白質體外定向進化

蛋白質體外定向進化指的是通過各種實驗技術,在體外模擬自然進化機制(隨機突變、重組和自然選擇),通過突變和重組一個或多個親本使基因發生變異,再通過對特定酶的特定功能或性質進行篩選,定向選擇有價值的非天然蛋白分子。因而本質上,體外定向進化是達爾文進化論在分子水平上的延伸和套用。

基本介紹

• 中文名：蛋白質體外定向進化
• 外文名：Protein directed evolution in vitro

研究背景

1859 年，達爾文在《物種起源》中提出了生物進化論學說，揭示了生物在遺傳、變異、生存鬥爭和自然選擇中是不斷發展變化的．近代生物學的發展使人們認識到蛋白質進化大多是由於某些點突變或修飾的積累，而在自然條件下，蛋白質性質或功能的改變通常需要很長時間．早期人們採取了各種誘變手段以期能夠對蛋白質性能進行改造，如最早在1982 年，Winter 等報導了通過基因定位誘變獲得改進的酪氨酸tRNA 合成酶．1983 年，Ulmer 在《科學》(Science) 上提出蛋白質工程(protein engineering)一詞，指按照人們的需求，通過對蛋白質信息和功能的分析，設計改造蛋白質分子．但當人們試圖基於蛋白質結構對其進行改造時，由於結構生物信息的匱乏以及蛋白質結構的複雜性，合理設計進行得十分困難，蛋白質工程的發展受到了嚴重製約。

蛋白質體外定向進化的發展拓寬了蛋白質工程的設計範圍，可在未知目標蛋白質結構信息和作用機制的情況下對蛋白質進行改造。蛋白質體外定向進化發展初期，科學家主要將其用於篩選和控制(或影響)所需表型．20 世紀中期，蛋白質體外定向進化被引入實驗室用於再現和研究自然進化進程．近年，定向進化更多地被用來改善蛋白質性能，改進蛋白質藥物的穩定性、半衰期、免疫原性，開發酶的新底物利用以及改進或拓展新的代謝途徑等。最近的研究表明，蛋白質體外定向進化被成功地套用在代謝途徑的關鍵酶設計、新底物催化功能的開發、創造全新功能蛋白質以及篩選和鑑別預期功能蛋白質中，在代謝工程和合成生物學領域發揮了重要作用。

主要方法

在體外分子定向進化策略中,兩個最關鍵的環節是構建目的基因的突變體庫和對不同突變基因表達的蛋白進行篩選。在構建分子多樣性最廣泛的突變體文庫方面,通常採用的方法是隨機突變和體外重組。在定向進化的實踐中,對不同的目標基因通常應選擇合適的方法,也可以將二者結合起來運用。目前常用的技術有易錯PCR、DNA改組、交錯延伸重組、體外隨機引發重組等。

易錯PCR

易錯PCR （error-prone PCR） 是指在擴增目的基因的同時引入鹼基錯配， 導致目的基因隨機突變， 然而， 經過一次突變的基因很難獲得滿意的結果， 由此發展出連續易錯PCR （sequential errorpronePCR）， 它是將一次PCR擴增得到的有用突變基因作為下一次PCR擴增的模板， 連續反覆的進行隨機誘變， 使每一次獲得的小突變累計而產生重要的有益突變。

在該方法中， 遺傳變化只發生在單一分子內部， 屬於無性進化（asexual evolution）， 和其他進化方法相比較， 它消耗精力和時間， 一般適合較小的基因片段（<800 bp）， 另外該方法還容易出現鹼基轉換現象。

DNA改組和外顯子改組

DNA改組（DNA shuffling） 又稱有性PCR（sexualPCR），是將一群密切相關的序列（如多種同源而有差異的基因或一組突變基因文庫） 在DNase I的作用下隨機酶切成小片段， 這些小片段之間有部分的鹼基序列重疊， 它們通過自身引導PCR延伸，並重新組裝成全長的基因。該方法的主要目的是創造將親本基因群中的突變儘可能組合的機會， 導致更大的突變， 最終獲得最佳突變組合的酶。在理論和實踐上它都優越於“寡核苷酸引導的突變” 和“連續易錯PCR”， 通過DNA改組， 不僅可以加速積累有益突變， 而且還可使酶的兩個或更多的最佳化性質合為一體。外顯子改組(exon shuffling) 類似於DNA改組，兩者都是在各自含突變的片段之間進行交換， 它特別適合於真核生物， 自然界中不同分子的外顯子發生同源重組， 導致不同外顯子結合， 是產生新蛋白的重要途徑之一。

雜合酶

雜合酶（hybrid enzyme） 是把來自不同酶分子中的結構單元（二級結構、三級結構、結構域） 或整個酶分子進行組合和交換， 以產生具有所需性質的酶雜合體。雜合酶可用於改變酶學或非酶學性質， 是了解酶的結構和功能以及相關酶的結構特徵的有力工具， 它還可以擴大天然酶的潛在套用， 甚至可以產生催化自然界不存在的新酶分子。

體外隨機引發重組

體外隨機引發重組（random-priming in vitrorecombination， RPR）， 以單鏈DNA為模板， 配合一套隨機引物， 先產生大量互補於模板不同位點的短DNA 片段， 由於鹼基的錯配和錯誤引發， 這些短DNA 片段中也會有少量的點突變， 在隨後的PCR反應中， 它們互為引物進行合成， 伴隨組合， 再組裝成完整的基因長度。[8]如果需要， 可反覆進行上述過程， 直到獲得滿意的進化酶性質。該法優於DNA 改組法的特點在於：

（1） RPR 可以利用單鏈DNA為模板， 故可10～20倍地降低親本DNA量；

（2） 在DNA 改組中， 片段重新組裝前必須徹底除去DNaseⅠ， 故RPR 方法更簡單；

（3） 合成的隨機引物具有同樣長度， 無順序傾向性， 並且在理論上， PCR 擴增時模板上每個鹼基都應被複製或以相似的頻率發生突變；

（4） 隨機引發的DNA合成不受DNA 模板長度的限制。

交錯延伸

交錯延伸(stagger extension process， StEP) 原理的核心是在PCR 反應中把常規的退火和延伸合併為一步， 並大大縮短其反應時間(55℃， 5s)， 從而只能合成出非常短的新生鏈， 經變性的新生鏈再作為引物與體系內同時存在的不同模板退火而繼續延伸。此過程反覆進行， 直到產生完整的基因長度， 結果產生間隔的含不同模板序列的新生DNA分子。StEP 法重組發生在單一試管中， 不需分離親本DNA 和產生的重組DNA。它採用的是變換模板機制， 這正是逆轉錄病毒所採用的進化過程。該法簡便且有效， 為酶的體外定向進化提供了又一強有力的工具。

過渡模板隨機嵌合生長

過渡模板隨機嵌合生長(random chimeragenesis on transient templates,RACHITT)是概念上與DNA改組明顯不同的、改進的基因家族重組技術,不包括熱循環、鏈轉移或交錯延伸反應。其原理是將原始基因的一條單鏈隨機切成小片段，通過退火雜交到一個臨時DNA模板上進行排序、修剪、空隙填補和連線,從而合成全長基因序列。該方法與傳統的DNA改組相比,其優勢在於它的高頻率、高密度重組頻率,並可在短至5 bp的序列同一區內產生交叉，比DNA改組方法高出幾倍,因而更具套用價值。

套用

蛋白質體外定向進化大大加速了人類改造蛋白質原有功能和開發新功能的步伐。其廣泛套用在與工業相關的催化酶方面, 主要體現在以下幾方面：(1) 提高酶的活性；(2)提高酶的熱穩定性；(3) 改變酶的底物特異性；(4) 創建新型蛋白酶。

改善酶催化效率

蛋白質體外定向進化可以有效地提高酶活性、解除抑制作用。2012 年，有報導利用epPCR 方法對植酸酶進行進化後，與出發菌相比，突變酶的比活力增強了61%，酶與底物親和力增加了53%，催化效率提高了84%。同時有研究者將蛋白質分子動力學與定向進化結合，在統計天冬氨酸激酶(AK3)家族的序列信息後，確定了與天冬氨酸激酶運動和耦合作用相關的殘基．隨後對這些殘基進行點突變，新得到了12 個對賴氨酸抑制效果不敏感的AK3 突變株，以及6 株減弱了天冬氨酸脫氫酶Ⅰ- 高絲氨酸脫氫酶(AK1-HD1)變構抑制作用的突變株．

提高酶穩定性

蛋白酶的穩定性主要體現在對pH 值的穩定性和熱穩定性兩方面，其對生物催化效率有著重要影響．酶穩定性的提高是蛋白質體外定向進化的重要套用之一。有研究者為獲得耐酸性的地衣芽孢桿菌α- 澱粉酶(BLA)，利用epPCR 對BLA 進行了定向進化，並得到了兩個重要的突變位點：T353I 和H400R．相比較與野生菌株，單一位點突變株Thr353Ile、His400Arg 以及雙位點突變株Thr353Ile/His400Arg 在pH 4.5 的條件下的Kcat/Km值分別提高了3.5 倍、6.0 倍和11.3 倍， 且Thr353Ile/His400Arg 突變株更耐受低pH 條件，同時其熱穩定性沒有明顯改變。

改變底物特異性

木糖是自然界中第二大豐富的可再生能源，利用木糖發酵生產乙醇有重大的經濟潛能，但主要用於生產乙醇的釀酒酵母不能夠有效利用木糖．將樹幹畢赤酵母中的木糖還原酶(PsXR)和木糖醇脫氫酶(PsXDH)引入釀酒酵母，經過兩步氧化還原反應可以使木糖轉變為木酮糖，從而被利用．但由於PsXR 和PsXDH 均特異性依賴NADPH，因此這種改造導致了細胞內還原力不平衡，降低了乙醇得率並生成大量副產物木糖醇．為消除胞內的氧化還原不平衡，人們試圖將依賴NADPH 的PsXR 和PsXDH 改造為NADH 依賴性。PsXDH 的底物特異性改造取得了一定的效果，而對PsXR 的改造沒有顯著效果

創造新型催化活性蛋白酶

隨著合成生物學的快速發展，設計目標生物體性狀，甚至構建新型蛋白質成為了蛋白質體外定向進化的重要發展方向。乙二醛酶Ⅱ是乙二醛酶系統的重要組成部分，催化S-D- 乳醯谷胱甘肽水解生成D- 乳酸和谷胱甘肽，其在結構上與其他金屬水解酶如β 內醯胺酶以及芳基硫酸酯酶水解酶有相似之處．為在現有的蛋白支架上改變酶的催化活性，研究者同時對金屬水解酶的催化活性位點和結合位點進行了分析，並對其活性位點的環狀區域進行了鹼基的插入或刪除，從而將β 內醯胺酶活性引入到了乙二醛酶Ⅱ的αβ/βα 金屬水解酶支架上．最終得到的進化蛋白evMBL8 完全不表現水解酶活性，但具有β 內醯胺酶活性，且其催化頭孢噻肟水解的(Kcat/Km)app值為每秒1.8×102 mol/L，表達evMBL8 的E. coli對頭孢噻肟的耐藥性提高了100 倍．儘管evMBL8的β 內醯胺酶活性低於天然β 內醯胺酶，但此案例仍成功顯示了蛋白質新功能可以通過定向進化的方法獲得。除此之外，蛋白質體外定向進化不僅能夠成功構建酶的新型催化功能，還可以獲得非天然的催化反應，如催化具有非天然底物的反應等。且結合蛋白質隨機進化策略可以進一步提高其催化效率。

理論意義

蛋白質體外定向進化在醫藥業、農業上也產生了巨大影響。重組蛋白質藥物在藥品中占有重要地位,其主要產品有細胞因子、生長因子和酶。通常情況下,許多這類產品有副作用, 可以引起嚴重的併發症,或者使用時有條件限制, 因而不利於廣泛套用。用蛋白質體外定向進化技術可以選擇性改造這些產品的基因, 獲取所需的性質,排除不利的活性。

定向進化不僅在工業、醫療方面對蛋白質的改造具有重要的意義, 而且, 它也非常適合於基礎理論的研究。對蛋白質分子進化得到的突變體進行分析, 為研究蛋白質的結構和功能的關係提供了新的工具。天然蛋白質序列中往往有很多是隨機遺傳漂移, 而不是功能性的適應。例如, 從適應不同環境的物種中提取出的蛋白質經常有幾十個胺基酸的不同, 其中只有一小部分是與特定功能差異有關的。大量的中性突變只能幹擾科學家辨別分子的規律。在實驗室的進化實驗中, 種系很清楚, 而且突變主要是適應性的。通過定向進化來研究蛋白質的結構和功能的關係,可為蛋白質的理性設計提供理論依據。