細胞破碎技術

細胞破碎技術是指利用外力破壞細胞膜和細胞壁，使細胞內容物包括目的產物成分釋放出來的技術，是分離純化細胞內合成的非分泌型生化物質（產品）的基礎。 結合重組DNA技術和組織培養技術上的重大進展，以前認為很難獲得的蛋白質現在可以大規模生產。

基本介紹

• 中文名：細胞破碎技術
• 類別：技術
• 目標：大規模生產蛋白質
• 成分：肽聚糖（peptidoglycan）

破碎阻力

細菌

幾乎所有細菌的細胞壁都是由肽聚糖（peptidoglycan）組成，它是難溶性的聚糖鏈（glycan chain），藉助短肽交聯而成的網狀結構，包圍在細胞周圍，使細胞具有一定的形狀和強度。短肽一般由四或五個胺基酸組成，如L-丙氨醯-D-谷氨醯-L-賴氨醯-D-丙氨酸。而且短肽中常有D-胺基酸與二氨基庚二酸存在。 破碎細菌的主要阻力是來自於肽聚糖的網狀結構，其網結構的緻密程度和強度取決於聚糖鏈上所存在的肽鍵的數量和其交聯的程度，如果交聯程度大，則網結構就緻密。

高壓連續流細胞破碎效果

酵母菌

酵母細胞壁的最裡層是由葡聚糖的細纖維組成，它構成了細胞壁的剛性骨架，使細胞具有一定的形狀，覆蓋在細纖維上面的是一層糖蛋白，最外層是甘露聚糖，由1,6一磷酸二酯鍵共價連線，形成網狀結構。在該層的內部，有甘露聚糖-酶的複合物，它可以共價連線到網狀結構上，也可以不連線。與細菌細胞壁一樣，破碎酵母細胞壁的阻力主要決定於壁結構交聯的緊密程度和它的厚度。

真菌

黴菌的細胞壁主要存在三種聚合物，葡聚糖（主要以β-1,3糖苷鍵連線，某些以β-1,6糖苷鍵連線），幾丁質（以微纖維狀態存在）以及糖蛋白。最外層是α-和β-葡聚糖的混合物，第2層是糖蛋白的網狀結構，葡聚糖與糖蛋白結合起來，第3層主要是蛋白質，最內層主要是幾丁質，幾丁質的微纖維嵌入蛋白質結構中。與酵母和細菌的細胞壁一樣，真菌細胞壁的強度和聚合物的網狀結構有關，不僅如此，它還含有幾丁質或纖維素的纖維狀結構，所以強度有所提高。

植物細胞

對於已生長結束的植物細胞壁可分為初生壁和次生壁兩部分。 初生壁是細胞生長期形成的。 次生壁是細胞停止生長後，在初生壁內部形成的結構。 目前，較流行的初生細胞壁結構是由Lampert等人提出的“經緯”模型，依據這一模型，纖維素的微纖絲以平行於細胞壁平面的方向一層一層敷著在上面，同一層次上的微纖絲平行排列，而不同層次上則排列方向不同，互成一定角度，形成獨立的網路，構成了細胞壁的“經”，模型中的“緯”是結構蛋白（富含羥脯氨酸的蛋白），它由細胞質分泌，垂直於細胞壁平面排列，並由異二酪氨酸交聯成結構蛋白網，徑向的微纖絲網和緯向的結構蛋白網之間又相互交聯，構成更複雜的網路系統。半纖維素和果膠等膠體則填充在網路之中，從而使整個細胞壁既具有剛性又具有彈性。 在次生壁中，纖維素和半纖維素含量比初生壁增加很多，纖維素的微纖絲排列得更緊密和有規則，而且存在木質素（酚類組分的聚合物）的沉積。因此次生壁的形成提高了細胞壁的堅硬性，使植物細胞具有很高的機械強度。

破碎方法

目前已發展了多種細胞破碎方法，以便適應不同用途和不同類型的細胞壁破碎。 破碎方法可規納為機械法和非機械法兩大類。

機械法

高壓勻漿破碎法（homogenization）

高壓勻漿器是常用的設備，它由可產生高壓的正向排代泵（positive displacenemt pump）和排出閥（discharge valve）組成，排出閥具有狹窄的小孔，其大小可以調節。細胞漿液通過止逆閥進入泵體內，在高壓下迫使其在排出閥的小孔中高速衝出，並射向撞擊環上，由於突然減壓和高速衝擊，使細胞受到高的液相剪下力而破碎。在操作方式上，可以採用單次通過勻漿器或多次循環通過等方式，也可連續操作。為了控制溫度的升高，可在進口處用乾冰調節溫度，使出口溫度調節在20℃左右。在工業規模的細胞破碎中，對於酵母等難破碎的及濃度高或處於生長靜止期的細胞，常採用多次循環的操作方法。

用高壓原理對細胞進行擠壓

振盪珠擊破碎法 (Skaking Bead)

將等體積的小量組織樣品與高密度的ZircoBeads放入可密封的2ml螺旋蓋微量管中,再加入緩衝液與穩定成份到1.5ml的體積, 用6500RPM振盪機高速上下振動8秒,休息8秒,再振動8秒即可.此方法是目前最快且一次可處理最多樣品的方法. 一台機器最多可以在一天處理2400支樣品.對小量且多樣的人很方便.

高速攪拌珠研磨破碎法（fine grinding）

超聲破碎

研磨是常用的一種方法，它將細胞懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁等研磨劑一起快速攪拌，使細胞獲得破碎。在工業規模的破碎中，常採用高速珠磨機 。

超音波破碎法（ultrasonication）

超音波破碎法利用超音波振盪器發射的15-25kHz的超音波探頭處理細胞懸浮液。 超音波振盪器有不同的類型，常用的為電聲型，它是由發生器和換能器組成，發生器能產生高頻電流，換能器的作用是把電磁振盪轉換成機械振動。超音波振盪器以可分為槽式和探頭直接插入介質兩種型式，一般破碎效果後者比前者好。

非機械法

滲透壓衝擊破碎法（osmotic shock）

滲透壓衝擊是較溫和的一種破碎方法，將細胞放在高滲透壓的溶液中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），由於滲透壓的作用，細胞內水分便向外滲出，細胞發生收縮，當達到平衡後，將介質快速稀釋，或將細胞轉入水或緩衝液中，由於滲透壓的突然變化，胞外的水迅速滲入胞內，引起細胞快速膨脹而破裂。

凍融破碎法（freezing and thawing）

將細胞放在低溫下冷凍（約-15℃），然後在室溫中融化，反覆多次而達到破壁作用。由於冷凍，一方面能使細胞膜的疏水鍵結構破裂，從而增加細胞的親水性能，另一方面胞內水結晶，形成冰晶粒，引起細胞膨脹而破裂。對於細胞壁較脆弱的菌體，可採用此法。

酶溶破碎法（enzyme lysis）

酶解是利用溶解細胞壁的酶處理菌體細胞，使細胞壁受到部分或完全破壞後，再利用滲透壓衝擊等方法破壞細胞膜，進一步增大胞內產物的通透性。溶菌酶（lysozyme)適用於革蘭氏陰性菌細胞的分解，套用於革蘭氏陽性菌時，需輔以EDTA使之更有效地作用於細胞壁。 真核細胞的細胞壁不同於原核細胞，需採用不同的酶。

化學破碎法（chemical treatment）

採用化學法處理可以溶解細胞或抽提胞內組分。常用酸、鹼、表面活性劑和有機溶劑等化學試劑

去垢劑破碎法（detergents）

蛋白質復性利用包含體與細胞碎片的密度差，用離心法將包含體與細胞碎片和可溶性蛋白質分開，獲得了乾淨的包含體，再對包含體溶解復性。這樣首先就擺脫了大量的雜蛋白、核酸、熱原、內毒素等雜質，使後面的分離純化簡單了。從這個角度上講，包含體的形成對分離純化亦有好處。