ada(腺苷脫氨酶)

ada(腺苷脫氨酶)

腺苷脫氨酶(Adenosine deaminase)是一種參與嘌呤代謝作用的酶。它是用作拆解食物組織中的核酸中的腺苷。在人體中,它主要參與了免疫細胞的製造;若該酶突變,會造成T細胞、B細胞、自然殺手細胞皆無法表現的嚴重複合型免疫缺乏症(SCID)

基本介紹

  • 中文名:ada
  • 外文名:EC:3.5.4.4 adenosine deaminase ADA
  • 定義:腺苷脫氨酶
  • 分布:人體組織中
簡介,結構,反應,催化機理,功能,病理學,異構體,臨床意義,檢測方法演變,第一代ADA測試,第二代ADA測試,第三代ADA測試,第四代ADA測試,

簡介

腺苷脫氨酶(也稱為腺苷氨基水解酶,或ADA)是參與嘌呤代謝的酶(EC3.5.4.4)。它需要從食物中分解腺苷和組織中核酸的轉換。它在人體中的主要功能是免疫系統的發育和維持。然而,ADA的完整生理作用尚未完全了解。

結構

ADA以小形式(作為單體)和大形式(作為二聚體 - 複合物)存在。在單體形式中,酶是多肽鏈,摺疊成8股平行的α/β桶,其圍繞作為活性位點的中央深口袋。除8箇中心β-桶和8個外周α-螺旋外,ADA還含有5個額外的螺旋:殘基19-76倍折成三個螺旋,位於β1和α1摺疊之間;兩個反平行的羧基末端螺旋位於β-桶的氨基末端。
ADA活性位點含有鋅離子,鋅離子位於活性位點的最深凹陷處,由來自His15,His17,His214,Asp295和底物的五個原子配位。鋅是活動所必需的唯 一輔助因子。
底物腺苷被穩定並通過9個氫鍵與活性位點結合。與基質嘌呤環大致共面的Glu217的羧基在適當位置與基質的N1形成氫鍵。Asp296的羧基也與底物嘌呤環共面,與底物的N7形成氫鍵。Gly184的NH基團處於與底物的N3形成氫鍵的位置。Asp296與Zn形成鍵離子以及底物的6-OH。His238也與底物6-OH形成氫鍵。底物核糖的3'-OH與Asp19形成氫鍵,而5'-OH與His17形成氫鍵。在活性位點的開口處,通過基質的2'-OH和3'-OH,在水分子上形成另外兩個氫鍵。
由於酶內活性位點的凹陷,基質一旦結合,幾乎完全與溶劑隔離。當結合時,基材對溶劑的表面暴露是自由狀態下基材的表面暴露的0.5%。

反應

ADA不可逆地使腺苷脫氨基,通過用氨基取代酮基將其轉化為相關的核苷肌苷。
然後肌苷可被另一種稱為嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)的酶衍生化(從核糖中除去),將其轉化為次黃嘌呤。

催化機理

所提出的ADA催化脫氨作用機理是通過四面體中間體進行立體特異性加成 - 消除。通過任何一種機制,作為強親電試劑的Zn激活水分子,水分子被鹼性Asp295去質子化以形成攻擊性氫氧化物。His238定向水分子並穩定攻擊氫氧化物的電荷。將Glu217質子化以將質子提供給底物的N1。
由於鋅,Asp295和His238殘基的位置,反應是立體特異性的,其全部面向底物的嘌呤環的B側。
已經觀察到對ADA的競爭性抑制,其中產物肌苷作用於競爭性抑制劑對酶活性起作用。

功能

ADA被認為是嘌呤代謝的關鍵酶之一。該酶已在細菌,植物,無脊椎動物,脊椎動物和哺乳動物中發現,具有高度的胺基酸序列保守性。高度的胺基酸序列保守性表明ADA在嘌呤補救途徑中的關鍵性質。
首先,人類的ADA參與免疫系統的發育和維持。然而,還觀察到ADA關聯與上皮細胞分化,神經傳遞和妊娠維持有關。還提出,除腺苷分解外,ADA還刺激興奮性胺基酸的釋放,並且是A1腺苷受體和異源三聚體G蛋白偶聯所必需的。腺苷脫氨酶缺乏會導致肺纖維化,表明長期暴露於高水平的腺苷可以加劇炎症反應而不是抑制它們。還已經認識到腺苷脫氨酶蛋白和活性在過表達HIF-1α的小鼠心臟中上調,這部分地解釋了在缺血應激期間表達HIF-1α的心臟中腺苷的減弱水平。

病理學

腺苷脫氨酶基因中的一些突變導致它不被表達。由此產生的缺陷是嚴重聯合免疫缺陷(SCID)的一個原因,特別是常染色體隱性遺傳。ADA水平不足也與肺部炎症,胸腺細胞死亡和T細胞受體信號缺陷有關。
相反,導致該酶過度表達的突變是溶血性貧血的一個原因。
有證據表明不同的等位基因(ADA2)可能導致自閉症。
ADA水平升高也與愛滋病有關。

異構體

有兩種ADA同種型:ADA1和ADA2。
ADA1存在於大多數體細胞中,特別是淋巴細胞和巨噬細胞中,它不僅存在於胞質溶膠和細胞核中,而且還存在於與二肽基肽酶-4(aka,CD26)連線的細胞膜上的外胚層中。ADA1主要參與細胞內活動,並且以小形式(單體)和大形式(二聚體)存在。小型到大型的相互轉換受肺中“轉換因子”的調節。
ADA2首次在人類脾臟中發現。隨後在包括巨噬細胞在內的其他組織中發現它與ADA1共存。這兩種同種型調節腺苷與脫氧腺苷的比例,增強了寄生蟲的殺滅。ADA2主要存在於人血漿和血清中,並且僅作為同型二聚體存在。

臨床意義

ADA2是人血漿中存在的主要形式,並且在許多疾病中增加,特別是與免疫系統相關的疾病:例如類風濕性關節炎,牛皮癬和結節病。在大多數癌症中血漿ADA2同種型也增加。ADA2不是普遍存在,而是僅在單核細胞 - 巨噬細胞中與ADA1共存。
可以使用高效液相色譜法或酶法或比色法測量總血漿ADA。也許最簡單的系統是測量腺苷在分解為肌苷時釋放的氨。在用腺苷的緩衝溶液溫育血漿後,氨與Berthelot試劑反應形成藍色,其與酶活性的量成比例。為了測量ADA2,在孵育之前加入赤 - 9-(2-羥基-3-壬基)腺嘌呤(EHNA)以抑制ADA1的酶活性。缺乏ADA1引起SCID。
ADA也可用於淋巴細胞性胸腔積液或腹膜腹水的檢查,因為這種低ADA水平的樣本基本上不考慮結核病。
結核性胸腔積液現在可以通過增加胸膜液腺苷脫氨酶水平,每升40 U以上來準確診斷。
克拉屈濱和Pentostatin是用於治療毛細胞白血病的抗腫瘤劑;它們的作用機制是抑制腺苷脫氨酶。
ada(腺苷脫氨酶)

檢測方法演變

近十幾年來,隨著對ADA的深入研究,檢測方法也不斷發展。目 前已發展了四代。

第一代ADA測試

ADA將腺苷 (Adenosine) 脫氨產生次黃苷(Inosine) 和氨 (NH3)。一個ADA活性單位在測試特定條件下每分鐘脫氨1μmole腺苷成為次黃苷。通過動態測量腺苷265nm處吸光度下降的速度,可以測算ADA的活性大小。Kaplan法 (1955) 由此建立。由於高底物濃度造成吸光度過高,該法僅適用於腺苷濃度低於40μM。如此低的底物濃度達不到底物飽和要求,造成ADA活性檢測失真。因此,該法不適用於臨床套用。

第二代ADA測試

原理為腺苷脫氨酶催化腺嘌呤核苷水解,產生次黃嘌呤核苷和氨。然後用Berthelot顯色反應(1859)測定反應過程中產生氨的量,從而計算血清ADA活性單位。所需試劑易配製,儀器簡單,但靈敏度低,易受外源性NH3影響,空白過高,不能直接測定紅細胞ADA活性。
同樣原因,ADA偶聯谷氨酸脫氫酶(Glutamate Dehydrogenase, GLDH)反應:
通過測量340nm處NADPH吸光度下降的速度來測算ADA活性。該法也因血清含氨干擾,以及測試系統中過高NADPH造成非特異性氧化而無成算。

第三代ADA測試

Kalckar氏套用ADA偶聯嘌呤核苷磷酸化酶(Purine nucleoside phosphorylase,PNP) 和黃嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase, XOD) 反應連續監測法。通過測量293nm處尿酸鹽吸光度上升的速度來測算ADA活性。
但是,293nm時血清吸光度太高,造成臨床套用不便。

第四代ADA測試

通過ADA偶聯PNP,XOD,過氧化氫酶(Catalase)和醛脫氫酶(Aldehyde dehydrogenase),藉助過氧化氫(H2O2)反應測量334nm處NADPH吸光度上升的速率來測算ADA活性。該法克服了以往ADA測試的困難,然而,鑒於試劑成本高,阻礙實際臨床使用。
最新對第四代測試方法的改進為偶聯PNP,XOD和過氧化物酶(Peroxidase, POD)反應。ADA酶解腺苷(Adenosine)脫氨產生次黃苷(Inosine);再通過PNP的作用,生成次黃嘌呤(Hypoxanthine);後者在XOD氧化下生成尿酸(Uric Acid)和過氧化氫(H2O2);最後在POD的作用下H2O2再與N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline (EHSPT)、4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine, 4-AA)反應(Trinder氏反應),生成紫紅色的有色醌(Quinone dye)。通過動態測量有色醌550nm處吸光度上升的速度來測算ADA的活性。從反應原理可知NH4+對該法無影響。其原理反應方程式如下:
反應具有測定精密度高,抗干擾能力強,適合自動化快速測定的特點,為臨床常規開展ADA檢測套用創造了有利條件。
邁克腺苷脫氨酶(ADA)檢測試劑盒性能指標
檢測方法:XOD-PAP法(第四代改良法),不與其它核苷反應,無NH4+影響,靈敏度高。
劑 型:液體雙試劑,直接使用,避免復溶引起瓶間差。
線性範圍:0~200U/L,γ2≥0.99
準 確 度:不準確度正常水平≤15%,異常水平≤10%。
穩 定 性:密閉避光貯存2~8℃可穩定12個月,開瓶上機2~8℃避光穩定30天。
抗干擾能力:標本中膽紅素≤342umol/L,血紅蛋白≤200mg/dl,甘油三酯≤8.47mmol/L,抗壞血酸≤4mg/dl 及NH4+對本試劑測定無影響。
適 用 性:適用於各種半/全自動生化分析儀。
參考範圍:4~22U/L(37℃),建議各實驗室建立自己的參考值範圍。

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