Cre-LoxP重組酶系統

Cre-LoxP重組酶系統

Cre/loxP重組酶系統,指的是條件性基因打靶、誘導性基因打靶、時空特異性基因打靶策略的技術核心,在新型基因打靶中獲得廣泛套用,是由Sternberg和Hamilton提出。

基本介紹

  • 中文名:Cre/loxP重組酶系統
  • 提出者:Sternberg和Hamilton
  • 提出時間:1981
  • 套用學科:生物學
  • 適用領域範圍:高等真核生物
  • 適用領域範圍:基因打靶
  • 隸屬:λ Int酶超基因家族
重組酶與序列,系統的特性,套用策略,

重組酶與序列

Cre重組酶於1981年從P1噬菌體中發現,屬於λ Int酶超基因家族。Cre重組酶基因編碼區序列全長1029bp(EMBL資料庫登錄號X03453),編碼由 343 個胺基酸組成的38kDa單體蛋白。它不僅具有催化活性,而且與限制酶相似,能識別特異的 DNA 序列,即 loxP 位點,使 loxP位點間的基因序列被刪除或重組。Cre重組酶有70%的重組效率,不藉助任何輔助因子,可作用於多種結構的 DNA 底物,如線形、環狀甚至超螺旋 DNA。它 是一種位點特異性重組酶,能介導兩個LoxP位點(序列)之間的特異性重組,使LoxP位點間的基因序列被刪除或重組。
LoxP(locus of X (cross)-overinP1)序列:來源於P1噬菌體,是由兩個13bp反向重複序列和中間間隔的8bp序列共同組成,8bp的間隔序列同時也確定了LoxP的方向。Cre在催化DNA鏈交換過程中與DNA共價結合,13bp的反向重複序列是Cre酶的結合域。其序列如下:
5' - ATAACTTCGTATA - GCATACAT - TATACGAAGTTAT - 3'
3' - TATTGAAGCATAT - CGTATGTA - ATATGCTTCAATA - 5'

系統的特性

Cre重組酶介導兩個LoxP位點間的重組是一個動態、可逆的過程,可以分成三種情況:
1、如果兩個LoxP位點位於一條DNA鏈上,且方向相同,Cre重組酶能有效切除兩個LoxP位點間的序列;
2、如果兩個LoxP位點位於一條DNA鏈上,但方向相反,Cre重組酶能導致兩個LoxP位點間的序列倒位;
3、如果兩個LoxP位點分別位於兩條不同的DNA鏈或染色體上,Cre酶能介導兩條DNA鏈的交換或染色體易位。
另外,Cre不僅可以識別LoxP的2個13bp的反向重複序列和8bp的間隔區域,而且當一個13bp的反向重複序列或者8bp的間隔區發生改變時仍能識別並發生重組。利用這一特點,人們在構建載體時可以根據需要改造LoxP位點序列,以用於特定的基因突變或修復,增加了該系統的套用範圍。

套用策略

基於Cre/loxP的基因打靶要分兩步來進行。首先要在胚胎幹細胞的基因組中引入loxP序列,這一步可以通過打靶載體的設計和對同源重組子的篩選來實現。下一步通過Cre介導的重組來實現靶基因的遺傳修飾或改變。Cre/loxP系統既可以在細胞水平上用Cre重組酶表達質粒轉染中靶細胞,通過識別loxP位點將抗性標記基因切除,又可以在個體水平上將重組雜合子小鼠與Cre轉基因小鼠雜交,篩選子代小鼠就可得到刪除外源標記基因的條件性敲除小鼠。或者將Cre基因置於可誘導的啟動子控制下,通過誘導表達Cre重組酶而將loxP位點之間的基因切除(誘導性基因敲除),實現特定基因在特定時間或者組織中的失活。

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