高效液相層析法（HPLC）是近二十年來發展起來的一項新穎快速的分離技術。它是在經典液相層析法基礎上，引進了氣相層析的理論具有氣相層析的全部優點。由於HPLC分離能力強、測定靈敏度高，可在室溫下進行，套用範圍極廣，無論是極性還是非極性，小分子還是大分子，熱穩定還是不穩定的化合物均可用此法測定。對蛋白質、核酸、胺基酸、生物鹼、類固醇和類脂等尤為有利。高效液相層析法的基本概念和分離理論與經典的液相色譜法及氣相色譜法一致，因而其塔板理論及動力學理論等都可用於高效液相層析。
基本介紹
- 中文名：高效液相層析法
- 高效液析儀：包括輸液系統、層析柱與檢測系統
- 類型與套用：固定相是具有吸附活性的吸附劑
- 離子交換層析：原理與普通離子交換相同
使用儀器,主要類型,
使用儀器
典型的高效液相層析儀包括輸液系統、層析柱與檢測系統三部分。流動相用一高壓泵輸入。這種高壓泵應滿足以下條件：①流量恆定，無脈動，並有較大的調節範圍。②能抗溶劑腐蝕。③有較高的輸出壓力，一般要達到15～300kg/c，也有的高達800kg/c。④泵的死體積要小。梯度洗脫裝置必須具備兩台高壓泵，一台輸送強溶劑，一台輸送弱溶劑，兩泵運轉速度用電腦控制，並可按一定的要求改變流動相的組成，以改善分離效果。一般用微量注射器直接進樣，也可採用六通閥門進樣。HPLC中所用的檢測器最多套用的是紫外吸收檢測，靈敏度可達ng水平。此外，還有螢光檢測器、示差析光檢測器、電化學檢測器等。
主要類型
⑴ 液-固吸附層析：固定相是具有吸附活性的吸附劑，常用的有矽膠、氧化鋁、高分子有機酸或聚醯胺凝膠等。液-固吸附層析中的流動相依其所起的作用不同，分為 “底劑”和洗脫劑兩類，底劑起決定基本色譜的分離作用，洗脫劑起調節試樣組份的滯留時間長短，並對試樣中某幾個組份具有選擇性作用。流動相中底劑與洗脫劑成分的組合和選擇，直接影響色譜的分離情況，一般底劑為極性較低的溶劑，如正已烷、環已烷、戊烷、石油醚等，洗脫劑則根據試樣性質選用針對性溶劑，如醚、酯、酮、醇和酸等。本法可用於分離異構體、抗氧化劑與維生素等。
⑵ 液-液分配層析：固定相為單體固定液構成。將固定液的官能團結合在薄殼或多孔型矽膠上，經酸洗、中和、乾燥活化、使表面保持一定的矽羥基。這種以化學鍵合相為固定相的液-液層析稱為化學鍵合相層析。另一種利用離子對原理的液-液分配層析為離子對層析。化學鍵合層析分：①極性鍵合相層析：固定相為極性基團，氰基、氨基及雙羥基三種。流動相為非極性或極性較小的溶劑。極性小的組份先出峰，極性大的後出峰，這稱為正相層析法，適用於分離極性化合物。②非極性鍵合相層析：固定相為非極性基團，如十八烷基（C18）、辛烷基（C8）、甲基與苯基等，流動相用強極性溶劑，如水、醇、乙腈或無機鹽緩衝液。最常用的是不同比例的水和甲醇配製的混合溶劑，水不僅起洗脫作用還可掩蓋載體表面的矽羥基，防止因吸附而至的拖尾現象。極性大的組份先出峰，極性小的組份後出峰，恰好與正相法相反，故稱反相層析。本法適用於小分子物質的分離，如肽、核苷酸、糖類、胺基酸的衍生物等。離子對分配層析分：①正相離子對層析：此法常以水吸附在矽膠上作為固定相，把與分離組份帶相反電荷的配對離子以一定濃度溶於水或緩衝液塗漬在矽膠上。流動相為極性較低的有機溶劑。在層析過程中，待分離的離子與水相中配對離子形成中性離子對，在水相和有機相中進行分配，而達到分離。本法優點是流動相選擇餘地大，缺點是固定相易流失。②反向離子對層析：固定相是疏水性鍵合矽膠，如C18鍵合相，待分離離子和帶相反電荷的配對離子同時存在於強極性的流動相中，生成的中性離子對在流動相和鍵合相之間進行分配，而得到分離。本法優點是固定相不存在流失問題、流動相含水或緩衝液更適用於電離性化合物的分離。
⑶ 離子交換層析：原理與普通離子交換相同。在離子交換HPLC中，固定相多用離子性鍵合相，故本法又稱離子性鍵合相層析。流動相主要是水溶液，pH值最好在被分離酸、鹼的pK值附近。
