液相色譜儀

液相色譜儀

利用混合物在液-固或不互溶的兩種液體之間分配比的差異,對混合物進行先分離,而後分析鑑定的儀器

基本介紹

簡介,按作用原理分類,工作原理,進樣系統,輸液系統,分離系統,套用,安裝,液相色譜柱的結構,色譜柱的安裝,故障處理,氣泡溢出,柱壓高,無指示,不穩定,峰分叉,重複性差,

簡介

液相色譜儀根據固定相是液體或是固體,又分為液-液色譜(LLC)及液-固色譜(LSC)。現代液相色譜儀由高壓輸液泵、進樣系統溫度控制系統色譜柱檢測器、信號記錄系統等部分組成。與經典液相柱色譜裝置比較,具有高效、快速、靈敏等特點。

按作用原理分類

1、吸附柱色譜法
2、分配柱色譜法
3、離子交換柱色譜法
4、凝膠柱色譜法

工作原理

系統由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲液器中的動相被高壓泵打入系統,樣品溶液經進樣器進入流動相,被流動相載入色譜柱(固定相)內,由於樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配係數,在兩相中作相對運動時,經過反覆多次的吸附-解吸的分配過程,各組分在移動速度上產生較大的差別,被分離成單個組分依次從柱內流出,通過檢測器時,樣品濃度被轉換成電信號傳送到記錄儀,數據以圖譜形式列印出來高效液相色譜儀主要有進樣系統、輸液系統、分離系統、檢測系統和數據處理系統,下面將分別敘述其各自的組成與特點。
液相色譜儀液相色譜儀

進樣系統

一般採用隔膜注射進樣器或高壓進樣間完成進樣操作,進樣量是恆定的。這對提高分析樣品的重複性是有益的。

輸液系統

該系統包括高壓泵、流動相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強為l.47~4.4X10Pa,流速可調且穩定,當高壓流動相通過層析柱時,可降低樣品在柱中的擴散效應,可加快其在柱中的移動速度,這對提高解析度、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動相貯存器和梯度儀,可使流動相隨固定相和樣品的性質而改變,包括改變洗脫液的極性、離子強度、PH值,或改用競爭性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質(即使僅有一個基團的差別或是同分異構體)都能獲得有效分離。

分離系統

該系統包括色譜柱、連線管和恆溫器等。色譜柱一般長度為10~50cm(需要兩根連用時,可在二者之間加一連線管),內徑為2~5mm,由"優質不鏽鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料製成,住內裝有直徑為5~10μm粒度的固定相(由基質和固定液構成).固定相中的基質是由機械強度高的樹脂或矽膠構成,它們都有惰性(如矽膠表面的矽酸基因基本已除去)、多孔性(孔徑可達1000?)和比表面積大的特點,加之其表面經過機械塗漬(與氣相色譜中固定相的製備一樣),或者用化學法偶聯各種基因(如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等)或配體的有機化合物。因此,這類固定相對結構不同的物質有良好的選擇性。例如,在多孔性矽膠表面偶聯豌豆凝集素(PSA)後,就可以把成纖維細胞中的一種糖蛋白分離出來。
另外,固定相基質粒小,柱床極易達到均勻、緻密狀態,極易降低渦流擴散效應。基質粒度小,微孔淺,樣品在微孔區內傳質短。這些對縮小譜頻寬度、提高解析度是有益的。根據柱效理論分析,基質粒度小,塔板理論數N就越大。這也進一步證明基質粒度小,會提高解析度的道理。
再者,高效液相色譜的恆溫器可使溫度從室溫調到60C,通過改善傳質速度,縮短分析時間,就可增加層析柱的效率。

套用

高效液相色譜法只要求樣品能製成溶液,不受樣品揮發性的限制,流動相可選擇的範圍寬,固定相的種類繁多,因而可以分離熱不穩定和非揮發性的、離解的和非離解的以及各種分子量範圍的物質。與試樣預處理技術相配合,HPLC所達到的高解析度和高靈敏度,使分離和同時測定性質上十分相近的物質成為可能,能夠分離複雜相體中的微量成分。隨著固定相的發展,有可能在充分保持生化物質活性的條件下完成其分離HPLC成為解決生化分析問題最有前途的方法。由於HPLC具有高解析度、高靈敏度、速度快、色譜柱可反覆利用,流出組分易收集等優點,因而被廣泛套用到生物化學、食品分析、醫藥研究、環境分析、無機分析等各種領域。高效液相色譜儀與結構儀器的聯用是一個重要的發展方向。液相色譜-質譜連用技術受到普遍重視,如分析氨基甲酸酯農藥和多核芳烴等;液相色譜-紅外光譜連用也發展很快如在環境污染分析測定水中的烴類,海水中的不揮發烴類,使環境污染分析得到新的發展。

安裝

液相色譜柱的結構

a、空柱由柱接頭、柱管及濾片組裝而成。
柱接頭採用低死體積結構,柱接頭是兩端螺紋組件,一端是為7/16英寸外螺紋,另一端是3/16英寸的內螺紋(國內外已規範化)。7/16英寸外螺紋與1/4英寸柱管(Φ6.35mm)連線,中間放置壓環用於密封。3/16英寸的內螺紋與1/16英寸(Φ1.57mm)的連線管連線,中間也放置壓環用於柱接頭的密封。為了儘量減少柱外死體積,在安裝色譜柱時,用Φ1.57mm連線管通過空心螺釘壓環後要儘量插到底,然後再擰緊空心螺釘。壓環被空心螺釘擠壓變形後緊箍在連線管上(連線管通過壓環後露出的管長度應嚴格控制在2.5mm長或其他固定尺寸)。
在兩端柱接頭內,柱管兩端各放置一片不鏽鋼濾片(或濾網),用於封堵柱填料不被流動相衝出柱外而流失。空柱各組件均為316#不鏽鋼材質,能耐受一般的溶劑作用。但由於含氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性,故使用時要注意,柱及連線管內不能長時間存留此類溶劑,以避免腐蝕。
b、柱填料:液相色譜柱的分離作用是在填料與流動相之間進行的,柱子的分類是依據填料類型而定。
正相柱:多以矽膠為柱填料。根據外型可分為無定型和球型兩種,其顆粒直徑在3—10 µm的範圍內。另一類正相填料是矽膠表面鍵合—CN,-NH2等官能團即所謂的鍵合相矽膠。
反相柱:主要是以矽膠為基質,在其表面鍵合十八烷基官能團(ODS)的非極性填料。也有無定型和球型之分。
常用的其他的反相填料還有鍵合C8、C4、C2、苯基等,其顆粒粒徑在3—10 µm之間。

色譜柱的安裝


a、拆開柱包裝盒,確認色譜柱的類型、尺寸、出廠日期以及柱內貯存的溶劑。
b、擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用。
c、 按柱管上標示的流動相流向,將色譜柱的入口端通過連線管與進樣閥出口相連線(如條件允許,建議在柱前使用保護柱);柱的出口與檢測器連線。連線管是外徑為1.57mm、內徑為0.1-0.3mm的不鏽鋼管。連線管的兩端均有空心螺釘及密封用壓環。在接管時一定要設法降低柱外死體積。連線管通過空心螺釘、壓環後儘量用力插到底,然後順時針擰緊空心螺釘,直到擰不動為止,再用扳手繼續順時針擰1/4-1/2圈,切記不要用力過大。如色譜柱通過流動相加壓後有漏液現象,請用扳手繼續順時針擰1/4圈,直至不漏液為止。

故障處理

氣泡溢出

流動相內有氣泡,關閉泵,打開泄壓閥,打開purg鍵,清洗脫氣,氣泡不斷從過濾器冒出,進入流動相,無論打開purge鍵幾次,都無法清除不斷產生的氣泡。原因過濾器長期沉浸於乙酸銨等緩衝液內,過濾器內部由於黴菌的生長繁殖,形成菌團,阻塞了過濾器,緩衝液難以流暢地通過過濾器,空氣在泵的壓力作用下經過濾器進入流動相。處理過濾器浸泡於5%硝酸溶液中,超聲清洗幾分鐘即可;亦可將過濾器浸泡於5%硝酸溶液中12~36小時,輕輕震盪幾次,再將過濾器用純水清洗幾次,打開泄壓閥,打開purge鍵清洗脫氣,如仍有氣泡不斷從過濾器冒出,繼續將過濾器浸泡於5%硝酸溶液中,如沒有氣泡不斷從過濾器中冒出,說明過濾器內部的黴菌菌團已被硝酸破壞,流動相可以流暢地通過過濾器。打開泄壓閥,打開泵,流速調至1.0~3.0ml/min,純水沖洗過濾器1小時左右。即可將過濾器清洗乾淨。關閉泄壓閥,純甲醇沖洗半小時即可。

柱壓高

⑴緩衝液鹽分如(乙酸銨等)沉積於柱內;
⑵樣品污染沉積。
處理對於第一種情況先用40~50℃的純水,低速正向沖洗柱子,待柱壓逐漸下降後,相應提高流速沖洗,柱壓大幅度下降後,用常溫純水沖洗,之後用純甲醇沖洗柱子30分鐘;對於第二種情況,由樣品的沉積引起污染的C18柱,和純水反向沖洗柱子,換成甲醇沖洗,接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖洗柱子,再用換成甲醇沖洗,然後用純水沖洗,最後甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上。

無指示

⑴泵密封墊圈磨損;
⑵大量氣泡進入泵體。
處理對於第一種情況,更換密封墊圈;對於第二種情況,在泵作用的同時,用一個50ml的玻璃針筒在泵的出口處幫助抽出空氣。

不穩定

原因系統中有空氣或者單向閥的寶石球和閥座之間夾有異物,使得兩者不能密封。處理工作中注意觀察流動相的量,保證不鏽鋼濾器沉入儲液器瓶底,避免吸入空氣,流動相要充分脫氣。如為單向閥和閥座之間夾有異物,拆下單向閥,放入盛有丙酮的燒杯用超音波清洗。

峰分叉

⑴色譜柱被污染;
⑵柱頭填料塌陷。
處理對於第一種情況,先用純水反向沖洗柱子,然後換成甲醇沖洗,接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖洗柱子(沖洗時間的長短由樣品污染的情況而定),再換成甲醇沖洗,然後用純水沖洗,最後甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上。如沖洗後依然出峰不佳,則考慮第二種情況。對於第二種情況,擰開柱頭,檢查柱填料是否硬結或塌陷。去除硬結部分(污染的填料),裝入新填料,滴一滴甲醇,填料下陷,再填,用與柱內徑相同的頂端平滑的不鏽鋼桿壓緊,再填平,滴甲醇,再壓緊反覆幾次,直至裝滿填平。柱頭用甲醇沖洗乾淨,擦淨柱外壁的填料,擰緊柱頭,用純甲醇沖洗30分鐘以上。

重複性差

⑴進樣閥漏液;
⑵加樣針不到位;
⑶液量不足。
處理對於第一種情況更換進樣閥墊圈;對於第二種情況保證加樣針插到底,注射樣品溶液後須快速、平穩地從LOAD狀態轉換到INJECT狀態,以保證進樣量的準確。日常工作中,液相色譜儀的保養非常重要,注意不要讓空氣進入輸液系統和高壓泵中,儲液器內的溶液如長時間未用應清洗儲液器並更換溶液,每次用完色譜儀後緩衝液要用純水沖洗乾淨,防止無機鹽析出或沉積;樣品的前處理也很重要,任何樣品都要儘可能地去除雜質,完全溶解,儘量減少對色譜柱的污染,以延長色譜柱的使用壽命,同時避免注射過濃的樣品溶液,以免殘留液在進樣閥內析出固體引起堵塞;色譜柱作好標記,用於不同分析目的的色譜柱不要混用等。

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