基本介紹
- 中文名：高效液相色譜儀
- 外文名：High Performance Liquid Chromatography
- 組成：儲液器、泵、進樣器、色譜柱等
- 醫療器械分類：臨床檢驗器械
- 一級產品類別：其他醫用分析設備
- 二級產品類別：液相色譜分析儀器
- 管理類別：Ⅱ類醫療器械
原理,1. 液固吸附色譜法,2. 液液分配色譜法,3. 離子交換色譜法,4. 分子排阻色譜法,延伸,色譜,結構及功能,1. 溶劑輸送系統,2. 進樣系統,3. 分離系統,4. 檢測系統,5. 數據處理和記錄系統,發展歷史,色譜特點,套用,國家標準,
原理
儲液器中的流動相被高壓泵打入檢測系統，樣品溶液經進樣器進入流動相，被流動相載入色譜柱（固定相）內，由於樣本溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配係數，在兩相中作相對運動時，經過反覆多次的“吸附-解吸”的分配過程，各組分在移動速度上產生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內流出，通過檢測器時，樣本濃度被轉換成電信號傳送到記錄儀，數據以圖譜形式輸出檢測結果。
根據分離機制的不同，HPLC原理可分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法及分子排阻色譜法。
1. 液固吸附色譜法
液固吸附色譜法中，固定相為固體吸附劑，根據各組分吸附能力差異而使組分得以分離。常用的吸附劑為矽膠或氧化鋁，大多數用於非離子型化合物。吸附色譜固定相可以分為極性和非極性兩大類。對流動相的要求為：
1) 選用的溶劑應當與固定相互不相溶，並能保持色譜柱的穩定性。
2) 選用的溶劑應有高純度，以防所含微量雜質在柱中積累，引起柱性能的改變。
3) 選用的溶劑性能應與所使用的檢測器相匹配，如果使用紫外吸收檢測器，就不能選用在檢測波長下有紫外吸收的溶劑；若使用示差折光檢測器，就不能用梯度洗脫。
4) 選用的溶劑應對樣品有足夠的溶解能力，以提高測定的靈敏度。
5) 選用的溶劑應具有低的黏度和適當低的沸點。
6) 應儘量避免使用具有顯著毒性的溶劑，以保證工作人員的安全。
液固色譜法是以表面吸附性能力為依據的，所以它常用於分離極性不同的化合物，也能分離那些具有相同極性基團，但數量不同的樣品。
2. 液液分配色譜法
固定相為液體，根據被分離的組分在流動相和固定相中的溶解度不同而分離。依固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法和反相色譜法。正相色譜法採用極性固定相，流動相為相對非極性的疏水性溶劑，常用於分離中等極性和極性較強的化合物；反相色譜法一般用非極性固定相，流動相為水或緩衝溶液，適用於分離非極性和極性較弱的化合物。其中，反相色譜套用最廣。
3. 離子交換色譜法
固定相是離子交換樹脂。樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行交換，根據各離子與離子交換基團具有不同的電荷吸引力而分離。
4. 分子排阻色譜法
分子排阻色譜法又稱凝膠色譜法，它是按照分子尺寸大小順序進行分離的一種色譜方法。分子排阻色譜法的固定相凝膠是一種多孔性的聚合材料，有一定的形狀和穩定性，利用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。根據所用流動相的不同，凝膠色譜法可以分為兩類：即用水溶劑做流動相的凝膠過濾色譜法(GFC)與用有機溶劑如四氫呋喃做流動相的凝膠滲透色譜法(GPC)。
延伸
在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分在固定相中滯留時間長，後流出色譜柱；K值小的組分則滯留時間短，先流出色譜柱。混合物中各組分的分配係數相差越大，越容易分離，因此混合物中各組分的分配係數不同是色譜分離的前提。
高效液相色譜法原理
高效液相色譜法原理在HPLC中，固定相確定後，K主要受流動相的性質影響。實踐中主要靠調整流動相的組成配比及pH值，以獲得組分間的分配係數差異及適宜的保留時間，達到分離的目的。
色譜
（high performance liquid chromatography,HPLC）也叫高壓液相色譜（high pressure liquid chromatography）、高速液相色譜（high speed liquid chromatography）、高分離度液相色譜（high resolution liquid chromatography）等或Efficient liquid chromatographyspectrometry。是在經典液相色譜法的基礎上，於60年代後期引入了氣相色譜理論而迅速發展起來的。它與經典液相色譜法的區別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜。又因分析速度快而稱為高速液相色譜。
高效液相色譜是套用最多的色譜分析方法，高效液相色譜系統由流動相儲液體瓶、輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器和記錄器組成，其整體組成類似於氣相色譜，但是針對其流動相為液體的特點作出很多調整。HPLC的輸液泵要求輸液量恆定平穩；進樣系統要求進樣便利切換嚴密；由於液體流動相粘度遠遠高於氣體，為了減低柱壓高效液相色譜的色譜柱一般比較粗，長度也遠小於氣相色譜柱。HPLC套用非常廣泛，幾乎遍及定量定性分析的各個領域。
使用高效液相色譜時，液體待檢測物被注入色譜柱，通過壓力在固定相中移動，由於被測物種不同物質與固定相的相互作用不同，不同的物質順序離開色譜柱，通過檢測器得到不同的峰信號，最後通過分析比對這些信號來判斷待測物所含有的物質。高效液相色譜作為一種重要的分析方法，廣泛的套用於化學和生化分析中。高效液相色譜從原理上與經典的液相色譜沒有本質的差別，它的特點是採用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測器和高效微粒固定相，適於分析高沸點不易揮發、分子量大、不同極性的有機化合物。
結構及功能
HPLC儀一般由溶劑輸送系統、進樣系統、分離系統（色譜柱）、檢測系統和數據處理與記錄系統組成，具體包括儲液器、輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀或數據工作站等幾部分。其中輸液泵、色譜柱和檢測器是HPLC儀的關鍵部分。
1. 溶劑輸送系統
儲液器：用來貯存數量足夠、符合要求的流動相。配有溶劑過濾器，以防止流動相中的顆粒進入泵內。
脫氣器：脫氣的目的是為了防止流動相從色譜柱內流出時釋放出氣泡進入檢測器，從而引起噪聲，不能正常檢測。
輸液泵：將儲液器中的流動相連續不斷地以高壓形式進入液路系統，使樣品在色譜柱中完成分離過程。
梯度洗脫裝置：是在分離過程中通過逐漸改變流動相的組成增加洗脫能力的一種裝置。
2. 進樣系統
進樣器：是將樣品送入色譜柱的裝置，進樣方式可以分為兩種：閥進樣或自動進樣。比較常用的是採用自動進樣器裝樣。
3. 分離系統
色譜柱：對樣品進行分離，是整個色譜系統的心臟，它的質量優劣直接影響到分離的效果。
4. 檢測系統
檢測器：將色譜柱連續流出的樣品組分轉變成易於測量的電信號，被數據系統接收，得到樣品分離的色譜圖。
5. 數據處理和記錄系統
對色譜數據進行處理，並參與HPLC儀器的自動控制。
發展歷史
1960年代，由於氣相色譜對高沸點有機物分析的局限性，為了分離蛋白質、核酸等不易氣化的大分子物質，氣相色譜的理論和方法被重新引入經典液相色譜。1960年代末科克蘭（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯（Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人開發了世界上第一台高效液相色譜儀，開啟了高效液相色譜的時代。高效液相色譜使用粒徑更細的固定相填充色譜柱，提高色譜柱的塔板數，以高壓驅動流動相，使得經典液相色譜需要數日乃至數月完成的分離工作得以在幾個小時甚至幾十分鐘內完成。
1971年科克蘭等人出版了《液相色譜的現代實踐》一書，標誌著高效液相色譜法 (HPLC）正式建立。在此後的時間裡，高效液相色譜成為最為常用的分離和檢測手段，在有機化學、生物化學、醫學、藥物開發與檢測、化工、食品科學、環境監測、商檢和法檢等方面都有廣泛的套用。高效液相色譜同時還極大的刺激了固定相材料、檢測技術、數據處理技術以及色譜理論的發展。
1960年代前，使用的填充粒大於100μm，提高柱效面臨著困境，後來的研究人員便採用微粒固定相來突破著一瓶頸。
色譜特點
高壓——壓力可達150～300 kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 kg/cm2以上。
高速——流速為0.1～10.0 mL/min。
高效——塔板數可達5000/米。在一根柱中同時分離成份可達100種。
高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。
HPLC與經典液相色譜相比有以下優點：
速度快——通常分析一個樣品在15～30 min，有些樣品甚至在5 min內即可完成。
解析度高——可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果。
靈敏度高——紫外檢測器可達0.01ng，螢光和電化學檢測器可達0.1pg。
色譜柱可反覆使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。
樣品量少，容易回收——樣品經過色譜柱後不被破壞，可以收集單一組分或做製備。
套用
高效液相色譜法只要求樣品能製成溶液，不受樣品揮發性的限制，流動相可選擇的範圍寬，固定相的種類繁多，因而可以分離熱不穩定和非揮發性的、離解的和非離解的以及各種分子量範圍的物質。
與試樣預處理技術相配合，HPLC 所達到的高解析度和高靈敏度，使分離和同時測定性質上十分相近的物質成為可能，能夠分離複雜相體中的微量成分。隨著固定相的發展，有可能在充分保持生化物質活性的條件下完成其分離。
HPLC成為解決生化分析問題最有前途的方法。由於HPLC具有高解析度、高靈敏度、速度快、色譜柱可反覆利用，流出組分易收集等優點，因而被廣泛套用到生物化學、食品分析、醫藥研究、環境分析、無機分析等各種領域。高效液相色譜儀與結構儀器的聯用是一個重要的發展方向。
液相色譜- 質譜聯用技術受到普遍重視，如分析氨基甲酸酯農藥和多核芳烴等； 液相色譜- 紅外光譜聯用也發展很快，如在環境污染分析測定水中的烴類，海水中的不揮發烴類，使環境污染分析得到新的發展。
國家標準
《高效液相色譜儀》（GB/T 26792-2011）《High performance liquid chromatography》於2011年12月1日實施。
