連續床

連續床樹脂用量較固定床少1/2～1/3左右，而且連續床工藝的進行、再生、清洗可在不同設備中進行，因此不需要備台。但連續床對水質適應能力較差，樹脂磨損嚴重，單台產水量少，所以在動力鍋爐水處理中套用也較少。

製備

連續床的製備簡單、快捷。

裝柱

將一定量合適的功能單體、配基和交聯劑 或催化劑 溶入溶劑中 , 混合均勻 , 立即加入到已洗淨的層析柱中。

聚合

讓上述單體溶液在層析柱中聚合 ,這是靠疏水作用、氫鍵或共價作用進行的。

壓縮或沖洗

聚合一段時間後 , 在床層的上端連線一台HPLC蠕動泵 ,靠泵的流動相對床層進行壓縮、沖洗 ,流速應等於或略高於分離時要採用的流速 ,同時 ,還可藉助柱上端的活塞進行壓縮。經上述方法製得的色譜柱稱為連續床。床層在聚合過程中形成緻密的網鏈交錯結構 , 網鏈之間形成許多“渠道” , 如圖 2 。渠道實質上與傳統色譜柱中顆粒空穴起著同樣的作用。渠道足夠大 , 其能允許生物大分子通過 , 但網鏈自身是無孔結構 , 生物大分子不能進出 , 從而減少了擴散路徑 , 提高了解析度。

種類

離子交換連續床色譜

1991年 , S. Hjerten 等 製備了陰離子交換連續床色譜。方法如下: 取 N , N′- 亞甲基雙丙烯醯胺 Bis 0.24 g , 加入到 9.5 mL、0.01 mol/L 磷酸鈉緩衝液 pH 值 6. 4 中 , 然後加入 0. 12 mL 烯丙基二甲基胺、0. 3 g 硫酸銨 , 攪拌溶解後 , 加入200μL 質量分數為10 %的過硫酸銨、200 μL 5 %四甲基乙二胺 , 混勻後 , 將溶液快速移入事先準備好的柱子中 , 密封 , 讓其交聯聚合 5 h; 然後泵入0.01 mol/L 的 tris- HCl 緩衝液 pH值 8.5 , 流速為0.5 mL/ min , 對床層進行壓縮。製得的連續床已成功地用於血紅蛋白、卵清蛋白、牛血清白蛋白、藻紅蛋白的分離。陽離子交換連續床色譜的製備方法基本同上 ,主要區別在於將烯丙基二甲基胺用 50μL 丙烯酸替代。

疏水作用連續床色譜

疏水作用連續床色譜的製備方法與離子交換連續床色譜類似 , 它是將一定量的Bis、硫酸銨溶於去離子水中 , 然後加入適量丙烯酸丁酯、過硫酸銨、四甲基乙二胺 , 交聯聚合 , 壓縮後製得。Chengming Zeng 成功地用該連續床色譜柱分離了細胞色素、肌血球素、核糖核酸酶、溶解酵素胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原和鐵蛋白。

反相連續床色譜

Frantisek Svec 小組製備的連續床可穩定使用 5 周以上 。因此 , 連續床的耐用性很好 , 並且如此寬pH值的使用範圍 , 使得連續床能用於多種物質的分離純化 , 在 pH = 3～11 內 , 連續床對緩衝液的容量很高 , 而這正是離子交換色譜所需要的 。

問題與展望

連續床與傳統柱色譜相比 , 最大的優勢在於它的孔道壁不允許蛋白質和多肽通過 , 因此它的解析度不隨流速變化而變化 , 甚至隨流速增加 , 解析度增大 , 這樣避免了傳統層析柱中解析度與流速二者不可兼顧的難題 。反相色譜實驗表明 , 隨著溫度的增加 , 解析度增加 , 但當到達一定溫度時 , 由於被分離蛋白變性 , 解析度反而下降 。Hjerten小組製得的連續床可在 pH = 1～11 範圍內穩定使用 3 周以上 , 在 pH 值為 12 時使用 6 h 。

連續床製備中最大的問題是聚合條件的實驗 , 如溫度、pH值、時間以及各組成的濃度等 ,希望能找到最佳條件 , 以致在壓縮後 , 渠道直徑不能太小而讓流動相不能通過。另一問題是連續床渠道壁不能太軟而易變形或太硬而易脆 , 故需尋找更好的單體。