變性梯度凝膠電泳系統

變性梯度凝膠電泳（DGGE）是一種根據DNA片段的熔解性質而使之分離的凝膠系統。DGGE將凝膠設定在雙重變性條件下，可以檢測DNA分子中的任何一種單鹼基的替代、移碼突變以及少於10個鹼基的缺失突變。由於具有精密控溫系統，比一般聚丙烯醯胺凝膠電泳具有更高的可重複性，被廣泛套用於基因突變檢測及相關研究。

基本介紹

• 中文名：變性梯度凝膠電泳系統
• 外文名：DGGE
• 類型：突變篩查方法
• 原理：化學變性劑處理

簡介

英文縮寫DGGE，這個方法是套用最早也是最常用的突變篩查方法之一,在過去的十年中經歷了很大的改進,並被診斷室所廣泛使用,最近有篇關於該問題的綜述(Fodde>和 Losekoot 1994 年)。

原理

如果 DNA 雙鏈分子全長不斷增加溫度或用化學變性劑處理,兩條鏈就會開始分開(解鏈)。首先解鏈的區域由解鏈溫度較低的鹼基組成。 G.C 鹼基對比 A.T 鹼基對結合得要牢固,因此 G. C 含量高的區域具有較高的解鏈溫度。同時影響解鏈溫度的因素還有相鄰鹼基間的吸引力(稱作“堆積”)。解鏈溫度低的區域,通常位於端部稱作低溫解鏈區( lower melting domain )。如果端部分開,那么雙螺旋就由未解鏈部分束在一起,這一區域便稱作高溫解鏈( high melting domain ) 。如果溫度或變性劑濃度繼續升高,兩條鏈就會完全分開。變性梯度凝膠電泳法依據首要的一點是： DNA 雙鏈末端一旦解鏈,其在凝膠中的電泳速度將會極劇下降。第二個根據是,如果某一區域首先解鏈,而與其僅有一個鹼基之差的另一條鏈就會有不同的解鏈溫度,因此,將樣品加入含有變性劑梯度的凝膠進行電泳就可將二者分開。最終,如果一雙鏈在其低溫解鏈區鹼基錯配(異源雙鏈),而與另一等同的雙鏈相比差別僅在於此,那么,含有錯配鹼基的雙鏈將在低得多的變性劑濃度下解鏈。事實上,樣品通常含有突變、正常的同源雙鏈以及配對的異源雙鏈,後者是在 PCR 擴增加時產行的。而含有錯配的雙鏈通常可以遠遠地與兩個同源雙鏈分開,這種分離效果使該方法靈敏度很高。

發展階段

主要事件

變性梯度凝膠電泳的發展經過： 1979 電泳系統發明（ Fisher 和 Lerman）1979 年， 1983 分離僅有一個鹼基之差的 DNA 雙鏈 （Fisher 和 Lerman）1983 年， 1985 於基因組 DNA 中檢測出一地中海貧血突變 （Myers 等） ；1985 年 使用異源雙鏈技術（ Myers 等 ）；1985 年 ，首次使用“ GC 夾板”技術 （Myers 等）；1985 年 1987 預測解鏈行為及分析用電腦程式出現 （Lerman 和 Silverstein）；1987 年 ，1989 “ GC 夾板”技術與 PCR 技術相連線（ Sheffield 等） ，1989 年 ，非標記檢測法問世 （Sheffield 等）

其他改進

1，在 PCR 反應過程中加入“ GC 夾板”( Top1992 年)，由一端進行 PCR 反應的引物有：帶有 15bp 鹼基接頭的引物和由 15bp 接頭和 35bp “ GC 夾板”構成的接頭 / 夾式引物。當然這就要求一個用特定引物擴增,另一個用帶有“夾板”的引物擴增,而且要用校讀多聚酶( Proof reading polymerase )以防止引入人為突變，而不是套用含有“ GC 夾板”的特定引物,這一方法也有可能減少耗費。

2，去除“ GC 夾板”或用化學“夾板”代替可能都會使操作簡便( Costes 等 1993 年 a ； Fernandez 等 1993 年)。此外,“ GC 夾板”由連線補骨脂的多個鹼基 A 替代,經過擴增,它就會與新加上去的配對鹼基 T 結合在一起,經光照射後與末端共價連線在一起。現已對此方法進行了深入的研究( Costes 等 1993 年 b )。 DNA 片段中特定突變通常會產生特定的異源雙鏈和同源雙鏈圖,所以檢測人員要能夠區分所檢測到的突變是否為以前所描述的突變。但是,兩個或更多突變產生的雙鏈圖可能比較相像,所以要確定檢測出的突變是否為新發現的突變,就可以通過再次分析前加入已知突變樣品( Guldberg 和 Guttler1993 年)而予以解決。如果已知突變與所檢測到的突變相同,那么就會產生複合雙鏈圖,這種方法可以不用進行序列分析而對突變做出鑑定。

3，Russ 和 Medjugorac(199 年 ) 報導用恆溫平板代替了培養槽。

4，最後,從安全形度出發,Guldberg等人(1994年)介紹了一種方法,將甲醯胺從恆變性劑凝膠電泳中去掉,他們還推測可以將變性劑從變性梯度凝膠電泳中去掉。

優缺點

優點

幾乎可以檢驗出所有突變 ，可將突變分子完好無損地同野生型分子分開用於進一步的分析 ，無須標記 ，電泳前只需一步操作， 可用於未經擴增的基因組 DNA ，也可檢測出象甲基化這樣的 DNA 修飾，

缺點

需要專門設備 需要用計算機對序列進行分析,需要進行預實驗 ，需要昂貴的“ GC 夾板”， 無法確定突變在 DNA 片段中位置， 需要用含有毒性物質甲醯胺的梯度凝膠 ，DNA 片段大小限制在 100-500bp 。

發展前景

1，由於 DGGE 法突變檢出率高,所以該方法可能已被診斷室用了一段時間了,如果用不同的 DGGE 技術加上“ GC 夾板”方法在一塊膠上可以篩查幾千 bp 長的片段。按照篩查模式來講,那將是比較理想的。從診斷角度考慮,理想的方法是在一塊膠上篩查一位患者所有的外顯子而不是對每一個外顯子用不同的膠板。 Guldberg 和 Guttler(1994 年 ) 的“寬幅度”( broad range )凝脈電泳將來可能會受人青睞,但都可能使突變檢出率有所損失,因此,“化學夾板”法可能會被廣泛使用。

2，從兩個方向上使用 DGGE 技術對於檢查整個基因組( Uitterlinden 和 Vijg1994 年)和腫瘤診斷( Verwest 等 1994 年)可能會更加重要。同時,將 DGGE 法用於自動化測序儀也有可能。

主要套用

Fodde 和 Losekoot ( 1994 年)的綜述給出了 DGGE 技術的大量套用。但,一些主要的套用在表 5 中給出。 DGGE 技術不僅可用於癌症和遺傳病的篩查及診斷,而且,在癌症(殘存性病灶、突變圖譜研究等)突變定量實驗中還用以檢測少數突變等。 線粒體 ，DNA 篩查（ Yoon 等 1991 年）； 因子Ⅷ基因， 血友病 A 篩查（ Higuchi 等 1991 年）； APC FAP 篩查 （Fodde 等 1992 年） ；CFTR 膽囊纖維化 篩查（ Ferec 等 1992 年 ）；PAH 苯丙酮尿症 篩查 （Guldberg 等 1993 年）； c-Ki ras 密碼子 12 (鼠) 定量，（ Soman 和 Wogan1993 年 ）；p53 急性白血病 篩查 （Pignon 等 1994 年） β血紅蛋白基因， β地中海貧血診斷 （Dozy 和 Kan1994 年 ）；RBI 成視網膜細胞瘤篩查 （ Blanquet 等 1995 年） Hmshi HNPCC 篩查 16 個外顯子 （Wijnen 等 1995 年）。

操作步驟

下面是用最常用的方法(即篩查外顯子)分析 DNA 片段的操作梗概,其同時使用了“ GC 夾板”和異源雙鏈技術。

步驟 1 儀器設備。已在很多場合下對此有所敘述(見下文),但也可以由研究者通過商業途徑獲得或自己製做。簡要地講,把凝膠灌到盒子裡然後放入大的加熱培養槽中,加入經充分攪拌的緩衝液。然後,將一個電極(陽極)與這個緩衝液相連,另一個電極(陰極)與上端的緩衝液相接,它可以將凝膠頂部與培養槽或低處緩衝液隔開。現在需要用一個小泵將緩衝液由外面(低處)泵到高處以抵消上端緩衝液向下面的流失。

步驟 2 對樣品序列進行分析為篩查作準備。由於使用“ GC 夾板”技術可使多數突變落入低溫解鏈區,所以用電腦程式選擇最佳引物位置就非常重要了,但仍需決定對哪一端連線“ GC 夾板”較好。大多檢測對外顯子和一些內含子的序列都進行了分析,因為多數突變位於外顯子中,而外顯子的大小多在 100-400bp 範圍內,所以可以有效地檢測出突變分子。一旦基因組 DNA 引物位置確定,電泳條件就可由以下兩步確定。

( a )使用 SQHTX 程式(另一個程式 MELT87 用於預測解鏈區,可作為校對,但如果使用了“ GC 夾板”就無須使用此程式。)這些程式可從 L. Lerman 博士那裡得到。

( b )對樣品進行正交凝膠電泳,見圖 2 ,選擇曲線陡峭部分兩端作為梯度凝膠的化學變性劑濃度範圍。

步聚 3 樣品製備。用兩個引的對基因組 DNA 進行擴增,一個引物的 5’ 端連以 40-45bp 富含 GC 的一段序列。因為必須有異源雙鏈形成才能保證檢出率接近 100% ,但由於可能形成突變純合子,所以必須加入等摩爾正常 DNA 分子,以在分析前形成異源雙鏈。

步聚 4 制膠。制膠時要選擇梯度範圍,這可用梯度混合器完成,兩個容器分別放有變性劑的極端濃度和合適濃度的丙烯醯胺。

步聚 5 電泳。經過電泳和溴化乙錠染色可以很好地分辯 1-2ug 樣品。當溫度平衡到 60 ℃後,移去梳子,加入混合有緩衝液的樣品,電壓控制在 60 到 160V 之間,電泳完後,以標準方法用溴化乙錠染色。分析所花時間PCR 擴增需要幾小時,凝膠準備 1 小時,電泳 3-6 小時,染色幾分鐘。因此 ,一項檢測分析僅需 7 小時,接到樣品 24 小時後分析就可完成分析工作。