基本介紹
- 中文名：融合子
- 外文名：Fusant
- 融合方式：化學融合法、電融合法等
- 篩選方式：營養缺陷型、抗性基因等
- 領域：細胞工程
- 用途：生物育種
定義,融合方法,化學融合法,電融合法,雷射誘導融合法,篩選方法,利用營養缺陷型篩選,利用抗藥性篩選,利用二親本不同的優良性狀篩選,利用供體滅活法篩選,利用雙親原生質體滅活法篩選,利用螢光染色法篩選,
定義
融合子是指兩種遺傳性不同的植物或微生物細胞去掉細胞壁之後，經過一定的手段將兩者融合成的一個新的細胞。
細胞工程是指在細胞水平上對生物進行改造的一項綜合性技術。對微生物而言，由於其結構簡單，為單細胞、簡單多細胞、甚至無細胞結構，因此從細胞層面上對其的改造已經歷了很長時間。如誘變育種，從某種意義上說就是在細胞水平上對物種進行改造的過程，但就現代微生物細胞工程來說，主要是指微生物的原生質體融合。
所謂原生質體融合是指用人工方法將遺傳性狀不同的兩菌株的原生質體融合在一起，使融合子攜帶雙親優良性狀的一種新技術。它是在有性雜交的基礎上發展起來的。我們知道，釀酒酵母的a型與a型菌株在自然條件下能發生融合。但不同種，不同屬，甚至同種的同一結合型之間的酵母菌株卻不能，如果將酵母菌的細胞壁去除，用物理、化學或生物的手段使兩者結合在一起，就有可能融合成一個新細胞，這樣就為微生物的育種開闢了一條新途徑。
融合方法
目前原生質體融合的方法主要有化學融合法、電融合法與雷射誘導融合法。
化學融合法
目前最常用的是PEG(聚乙二醇)助融法。將兩親本的原生質體等量混合在高滲液中，加入PEG助融，輕輕振盪促使原生質體融合。PEG作為促融劑，因其單體聚合程度不同而分子量差異很大，所以不同種的原生質體採用不同分子量的PEG。細菌一般採用30%～50%(w/v)的PEG，同時加入Ca2+與DMSO進一步促融，時間約為60s。真菌則採用25%～30%的高分子量PEG，pH9．0為佳，也需要加入Ca2+提高融合。而麴黴菌則採用20%PEG6000，母液為1～50mmol/L甘氨酸，pH7．5，處理時間為10～30min，融合頻率可達0．1%。Kavanagh在對釀酒酵母或白色念珠菌的融合實驗中，採用PEG 3350，濃度分別為40%和60%，pH7．0，結果表明，對於釀酒酵母用40%PEG加lmmol/L乙酸鈣系統融合頻率最高，而對於白色念珠菌，PEG濃度對實驗結果沒有影響，但在pH4．7的條件下，融合效果明顯高於pH 7．0。
電融合法
電融合法是利用直流或交流電場，使兩親本的原生質體進行融合。原生質體在電場中極化成偶極子，沿電力線排列成串珠狀，在兩極問的高壓由脈衝擊下擊穿緊密接觸的細胞質膜，在細胞膨壓的作用下完成融合。此法具有融合頻率高，對細胞無化學毒害，還具有空間定向和時間同步可調控性，在顯微鏡下進行電融合，還可觀察到融合的過程，此法的一個缺點是電場大小不易控制，如果電場大容易使原生質體大量死亡。
雷射誘導融合法
利用雷射束對相鄰的兩個原生質體接觸區進行穿孔，使原生質體進行融合。原理與電融合法相同。在操作時也要注意雷射束的強度。
篩選方法
假設用於原生質體融合的兩親本的基因型分別為A型和B型，那么經過融合後，整個群體中含有5種類型，即A型、AA型、AB型、BB型、B型。其中只有AB型才有可能形成真正的雜合細胞，而其餘4種均被淘汰。但AB型融合子在整個群體中的比例是很小的。所以選用適當的方法從融合群體中選擇目的融合子顯得非常重要。
利用營養缺陷型篩選
利用營養缺陷型作為篩選標記是最傳統的有效而直接的辦法，即二親本是不同的營養缺陷型，融合後於高滲基本培養基上再生，融合子由於遺傳物質的互補回復為野生型從而可以在基本培養基上生長，而親本則不能生長。培養基中的滲透壓穩定劑一般為17%的蔗糖。對於K氏釀酒酵母，在再生培養基中加入酵母細胞壁合成前體物質或者牛血清白蛋白及聚乙烯吡咯烷酮(PVP)可以明顯提高融合子的再生能力。營養缺陷型篩選法可以分為兩種，一種為直接法，即將融合液塗布在基本培養基上，直接從中選出融合子；另一種為間接法，即讓親本與融合子都可以得到再生，長出菌落後接種到不同的選擇培養基上，從選擇培養基上檢出融合子。套用營養缺陷型選擇存在的一個缺點就是親本要有不同的營養缺陷，而獲得不同的營養缺陷比較麻煩，涉及到用物理的或者化學的方法進行誘變。誘變的結果可能造成一些優良性狀丟失。
利用抗藥性篩選
微生物的抗藥性是其菌種的特性，是由遺傳物質決定的。不同微生物對某一種藥物的抗性存在差異，利用這種差異或者與菌種的其他特性結合起來就可以對融合子進行篩選。
利用二親本不同的優良性狀篩選
如果二親本具有不同的優良性狀，比如能代謝不同的底物，它們的融合子就同時具有親本的優良性狀。例如在篩選高溫乙醇發酵的酵母的實驗中就是利用二親本的不同優良性狀。釀酒酵母A001產酒率為10．2%，能發酵麥芽糖。但是在45℃的條件下不能生長；克魯維酵母Y304為呼吸缺陷型，產酒率為3．6%，不能發酵麥芽糖，但是能在45℃的條件下生長。將這兩種親本酵母融合後，融合子既能發酵麥芽糖又能在45℃的條件下生長。這樣就可以在含有麥芽糖的培養基中，在45℃的培養箱中篩選融合子。
在篩選能利用澱粉的大腸桿菌的實驗中，親本大腸桿菌是不能利用澱粉的，其為革蘭陰性；枯草桿菌是可以利用澱粉的，其為革蘭陽性。將二親本的原生質體進行融合，然後在含有澱粉的培養基上進行再生。隨機挑取在再生培養基上長出的菌落，於油鏡下觀察，選取沒有芽孢的細菌製成菌懸液，在澱粉培養基上於28。C培養24h，加碘液，出現透明圈，挑取出現透明圈的細菌在油鏡下觀察確認沒有芽孢的存在。重複一次實驗以進一步確認。
在構建具有殺傷能力並可以利用澱粉的酵母實驗中，利用融合子既具有殺傷性能又可以在含有以澱粉為唯一碳源的培養基生長的這一性質，就可將融合子與親本分開。
利用供體滅活法篩選
親本之一的原生質體經過物理方法(紫外線照射、短時加熱等)處理失活而作為遺傳物質的供體，然後與另一親本的原生質體進行融合。利用該法可以省去一株親本的原生質體製備步驟，但是融合率比較低。嗜殺啤酒酵母FP5—24的選育就是利用該法篩選的。首先用紫外線滅活含有嗜殺質粒的供體酵母的原生質體(確保滅活後不能再生)，然後用該滅活的原生質體與啤酒酵母CDW-4的原生質體融合。利用受體酵母對嗜防毒素的敏感性選出融合子FP5—24。該融合子的釀造性能與受體菌保持相同但是具有嗜殺活性。
利用雙親原生質體滅活法篩選
將二親本的原生質體用不同的理化手段進行處理，相應地使某一部位的生理結構被損傷而失去活性，但不是將原生質體徹底殺死。滅活後的原生質體不能再生，而由損傷部位不同的原生質體相結合形成的融合子，因為損傷部位可以互補則可以再生。由於雙親原生質體滅活融合減少了尋找穩定的遺傳標記的繁瑣的工作以及由此可能帶來的親本優良性狀的丟失，而且使融合子的篩選變得直觀簡便，大大提高了篩選效率。但是與上述篩選方法相比，它的融合效率是較低的。周東坡等人通過將酵母親本原生質體分別在52℃水浴中處理30min以及用紫外線照射20min，然後將處理後的原生質體融合，直接篩選融合子，得到一株啤酒酵母的新菌株，具有絮凝性比親本好、雙乙醯含量比雙親低、生長比親本快的優良性狀。
利用螢光染色法篩選
利用不同的螢光色素來標記親本的原生質體，使其在特定波長光的激發下發出不同的螢光，融合後在螢光顯微鏡下挑選具有雙親兩種螢光的融合子。利用該方法要考慮螢光色素對原生質體的活性影響以及兩種色素的分辨度，該方法與上述方法相比在操作上比較麻煩，所以運用該方法來篩選比較少。
