肽核酸晶片

用肽核酸(peptide nucleic acids，PNA，一類DNA類似物，以胺基酸取代糖磷酸主鏈)製成探針製成肽核酸晶片，PNA與互補的DNA或RNA雜交時，比類似的DNA寡聚物有著更高的親和性，而且PNA很穩定，對提高基因晶片的檢測效果，防止假陽性方面有一定的進步。

基本介紹

• 中文名：肽核酸晶片
• 外文名：peptide nucleic acid miroarray
• 簡寫：PNA miroarray
• 探針：肽核酸
• 優點：防止假陽性等
• PNA：一類DNA類似物

晶片的載體的預處理

晶片製備之前要對載體進行修飾，使其表面有可進行化學反應的活性基團，以便與生物分子進行偶聯，並使載體具有良好的穩定性和生物兼容性。對支持物進行表面處理的原因有兩方面。首先，支持物表面上要有一種合適的功能基團以連線探針，並使探針穩定地固定於支持物表面，以防止雜交後清洗時被洗脫。經處理後其表面衍生出氨基、醛基、異硫氰酸基及環氧基團。這些活性基團可與DNA分子中的磷酸基、氨基、羥基等基團形成離子鍵或共價結合而使列印在上面的DNA牢固地固定在支持物表面。其次，支持物表面經處理後．可減少親水性探針在其表面的擴散，因而提高了點陣密度。

基因晶片的製作方法

基因晶片的製作一般有兩種方法，一種為原位合成(insitusynthesis)．適用於寡核苷酸；一種為合成後交聯(post—synthetic attachment)也叫點樣法。

①原位合成法。此方法製作的晶片常被稱作DNA晶片，即在晶片上原位合成寡核苷酸探針，合成的探針被直接有序地固化於支持物上，以用於雜交分析。原位合成法製備的晶片是高密度的，核酸探針長度較短，最適用於DNA再測序、查明點突變，以及基因轉錄表達分析等。

光導原位合成法是常用的原位合成法，它是在經過處理的載玻片表面鋪上一層連線分子(linker)，其羥基上加有光敏保護基團，可用光照除去。用特製的光欄(light mask)(光刻掩膜，photoliographic mask)保護不需要合成的部位，而暴露合成部位。在光作用下去除羥基上的保護基團，游離羥基，利用化學反應加上第一個核苷酸，所加核苷酸種類及在晶片上的部位預先設定，引入的核苷酸帶有光敏保護基團，以便下一步合成。然後按上述方法在其他位點加上另外3種核苷酸完成第一位核苷酸的合成，因而N個核苷酸長的晶片需要有4N個步驟。每一獨特序列的探針稱為一個“feature”．這樣的晶片便具有4N個“feature”(探針位點，每個探針位點含有幾百萬個相同的探針)，包含了全部長度為N的核苷酸序列。這種原位合成的方法無需製備處理克隆和產物。運用這種方法製作的晶片探針間隔為5～10μm，密度可高達10探針/cm。該方法的優點在於合成速度快、步驟少、合成探針陣列量大；缺點是合成反應產率較低，不到95%，探針長度較短，一般為2～8 bp。此外，如果每步去保護不徹底會導致雜交信號模糊，信噪比減低。為此，有人用電子射線和酸作為去保護劑以提高產率及點陣密度。

②點樣法。點樣法是將合成好的探針、cDNA或基因組DNA通過特定的高速點樣機器人直接點在晶片上，然後經過紫外線照射或Schiff鹼連線法固定、變性、沖洗和晾乾而成。以此方法製作的晶片也被稱為微點陣(microarray)，可將較大的核酸片段(大於100 bp)物理地固定在介質上。該方法的探針製備是在晶片以外採用常規分子生物學技術獲得的，如PCR、分子克隆、人工合成DNA片段等。將製備好的探針通過手工或自動點樣裝置點在經特殊處理的載玻片或其他材料上即可，主要用於診斷、檢測病原體及其他特殊要求的中、低密度晶片的製備。探針可以是合成的短寡核苷酸片段，也可以是從基因組中製備的基因片段或cDNA；可以是雙鏈，亦可採用單鏈的DNA或RNA片段。也有人用肽核酸(peptide nucleic acids，PNA，一類DNA類似物，以胺基酸取代糖磷酸主鏈)製成探針。

樣品製備及樣品的標記方法

樣品的製備和標記是基因晶片實驗流程的一個重要環節，待分析基因一般不能與晶片探針直接雜交，在雜交之前必須進行分離、擴增和標記。根據樣品來源、基因含量和分析目的不同，採取的基因分離、擴增和標記的方法不同。常規的基因分離、擴增和標記技術完全可以採用。樣品的標記方法有放射性核素標記法及螢光色素法等。放射性核素標記法中33P dCTP是首選的放射性標記物。因為其放射能量較大，尤其是在晶片上各個探針的物理距離較近時，雜交信號強的位點容易影響到鄰近的雜交信號弱的位點的情況下，選用33P dCTP可以更好地檢測出雜交信號弱的位點的信息。除了33P外．其他的放射性標記物還有3H、14C、35S等。放射性核素標記物的缺點是其放射污染。

螢光色素法中最常用的是Cye3一dUTP和Cye5一dUTP。其優點是和逆轉錄產物有很好的結合性能、好的光穩定性以及它們的激發光譜和發射光譜範圍差別較大，使得光學檢測時解析度較強。另外比放射性核素還有一個明顯的優點就是能夠避免放射污染。但是信號較弱，易受背景噪聲的干擾，尤其是當待測物質的量較少時，檢測的敏感性不佳。

生物分子雜交反應

基因晶片與檢測基因的雜交過程與一般的分子雜交過程基本相同，但雜交條件的選擇需考慮多方面的因素，如雜交反應體系中鹽濃度，探針的濃度、GC含量、所帶電荷、序列組成，檢測基因序列的濃度，探針與晶片之間連線臂的長度及種類、檢測基因的二級結構以及雜交的時間、溫度、晶片的類型等因素。如用於基因表達檢測，需要長曆時、低溫和高鹽條件的較嚴謹性雜交，而用於突變檢測則需要短歷時、高溫和低鹽條件高嚴謹性雜交。由於基因晶片影響因素很多，所以要合理設定異種核酸平行實驗、核酸質量、檢測對照、封閉對照、歸整化對照，以保證結果的準確性和重複性。

最近，為提高晶片雜交的準確性，出現了肽核酸晶片(peptide nucleic acid miroarray，PNAmicroarray)，PNA與互補的DNA或RNA雜交時，比類似的DNA寡聚物有著更高的親和性，而且PNA很穩定，對提高基因晶片的檢測效果，防止假陽性方面有一定的進步。

雜交反應的信號檢測及分析

晶片經雜交反應後，各反應點形成強弱不同的光信號圖像，用晶片掃瞄器和相關軟體加以分析，即可獲得有關的生物信息。如果是用同位素標記樣品，其後的信號檢測即是放射自顯影，通過放射自顯影顯示雜交信號的強弱與分布；若用螢光標記，則需要一套螢光掃描及分析系統，對相應探針陣列上的螢光強度進行分析比較，經計算機軟體如Genepix 3.0軟體ImaGene 3.0軟體分析，將圖像數位化，即可獲得有關的生物信息。

目前，用於晶片的螢光信號掃描和定量分析方法主要有兩種：①利用電荷耦合裝置(charge—coupled devices，CCD)檢測的攝像系統；②利用雷射共聚焦原理基於光電倍增管(photomulti—plier tube，PMT)檢測的掃描系統。由於基因晶片獲取的信息量大．所以對基因晶片雜交數據的分析、處理、查詢、比較等需要一個標準的數據格式。目前，一個大型的基因晶片的資料庫正在構建中，若能將各實驗室獲得的基因晶片的結果集中起來，那么今後對數據的交流及結果的評估與分析將非常有利。近年來還發展了多種檢測方法，如質譜法、化學發光法、光導纖維法等。