結構光照明螢光顯微技術:簡介,發展歷史,結構光照明,工作原理,基本成像原理,非線性

結構光照明螢光顯微鏡是基於常規螢光顯微鏡，通過對其照明方式的改進，以特定結構光成像，從現突破衍射極限，獲得高解析度樣品信息，進而由傅立葉變換獲得樣品顯微圖像的一種光學顯微鏡。

基本介紹

中文名：結構光照明螢光顯微技術
外文名：Structure Illumination Microscopy
縮寫：SIM
發明時間：2005年
發明者：Mats Gustafsson
技術分類：超解析度顯微成像技術

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簡介

發展歷史

照明在光學顯微鏡中一直起著十分重要作用。在一個多世紀前提出的柯勒照明，一直是光學顯微鏡的主要照明技術。近幾十年來，發展出許多新的照明技術，意在提高顯微鏡的某些成像能力。然而，它們中的大多數不適合在寬場條件下觀察，因此在顯微鏡使用廣泛的領域，如細胞生物學和微尺度輪廓測量中受到了限制。2005年由Mats Gustafsson開發並提出的結構光照明顯微方法，為寬場顯微鏡技術實現了解析度性能上的突破。此外，它也與現有顯微鏡兼容。該方法通過在樣本本身或其圖像上疊加明確定義的圖案來修飾照明光，對所得圖像套用計算技術以去除結構光照明的影響，並獲得預期的高質量圖像。這種方法在過去十多年間迅速發展，已經成為細胞生物學和工程學中對微觀物體進行光學切片、超解析度成像、表面分析和定量相位成像的關鍵照明技術。

結構光照明

結構光照明是一種通過改變照明光空間結構的照明方式，通常照明的結構光是一個載頻條紋，該照明方式可套用於角度、長度、振動等的測量，並廣泛套用於三維成像。這種特別的照明方式通過形成摩爾紋（Moire fringes）來使得在常規照明方式下無法分辨的一些高解析度信息得以變得可見。

實際實驗過程中在照明光路中插入一個空間光調製器（如光柵，或者數字微鏡陣列DMD等），照明光受光柵的調製後經物鏡投影在樣品上，這樣在樣品的焦平面收到調製光的照射，在遠離焦平面也不受影響，最終調製光所產生的螢光信息通過成像系統被CCD接收，之後通過傅立葉變換將空間域和頻域進行變化，從而獲得圖像。

工作原理

基本成像原理

普通光學顯微鏡的成像過程可以通過點擴展函式進行描述，通過對點擴展函式進行傅立葉變換，可獲得顯微系統的光學傳遞函式。由於衍射極限的存在，光學傳遞函式限制了通過顯微系統的信息量，只允許低頻信息通過系統，濾除代表細節的高頻信息，即限制了系統的解析度。

結構光照明顯微鏡實現超分辨的原理，就是利用特定結構的照明光在成像過程把位於光學傳遞函式範圍外的一部分信息轉移到範圍內，利用特定算法將範圍內的高頻信息移動到原始位置，從而擴展通過顯微系統的樣品頻域信息，使得重構圖像的解析度超越衍射極限的限制。

對於光學顯微鏡系統，光學傳遞函式的三維結構是圓環結構，在零頻位置存在凹陷。凹陷帶來的後果就是CCD 上記錄的信息不僅包含物鏡焦平面上的樣品信息，同時包含焦平面外的樣品信息。由於受到焦平面外的信息的干擾，常規螢光顯微鏡無法獲得層析圖像。三維結構光照明顯微鏡提高解析度、獲得層析圖像的原理，就是利用特定結構的照明光來獲得樣品的高頻信息，採用特定算法在橫向和縱向上擴展樣品頻域信息的同時彌補凹陷帶來的影響。

非線性SIM

線性結構光照明顯微鏡解析度的提高取決於結構照明光空間頻率的大小，由於結構照明光也是通過光學系統照射到樣品表面的，它同樣受到衍射極限的限制，所以解析度無法突破2 倍衍射極限(不考慮照明光和螢光發射波長的不同)。為突破這個限制，螢光分子的非線性效應被引入結構光照明顯微鏡。

Gustafsson提出了一種基於螢光分子激發態飽和效應的非線性結構光照明顯微鏡。螢光分子中處於激發態的電子具有螢光壽命，即單個螢光壽命內一個螢光分子只能發射一個光子。當激發光的能量超過一個閾值(單個螢光壽命單個吸收界面內激發光子大於1)的時候，發射光將與照明光不再保持線性關係。這種非線性關係就相當於在照明光中引入多項空間頻率數倍於原始照明光頻率的諧波成分，在頻域空間這些諧波成分就相當於位於不同頻率位置的多個δ 函式。δ 函式使更多頻率更高的高頻信息被移到FOT的圓內，採用與二維結構光照明顯微鏡相同的算法，可以將獲得的高頻信息分離並移動到對應位置上擴展頻域信息，通過改變照明條紋的方向，可以使頻域信息在各個方向上得到均勻擴展。理論上，非線性效應引入的諧波成分是無限的，但是由於受到噪聲的影響，只有有限項的諧波能夠被用於提取高頻信息。

分類

通過改變寬場螢光顯微鏡照明光的結構就可以得到結構光照明螢光顯微鏡，因此，結構光的發生裝置是這類顯微鏡的關鍵，其餘成像部分跟普通的螢光顯微鏡類似。根據結構光發生裝置的區別，SIM可分為以下三種類型：

光柵型

這類結構光照明螢光顯微鏡利用光柵來產生餘弦結構照明光。光源發的光被耦合進多模光纖，出射光被透鏡準直成平行光，經過線偏振片照射光柵，發生衍射，在光路中加入掩膜，只允許±1 級的衍射光通過並聚焦在物鏡的後焦面上，經過物鏡重新變為平行光，兩束光在樣品表面發生干涉，產生餘弦結構光照明樣品，樣品發出的螢光經過分色鏡在CCD 上成像。這種方法適用於二維結構光照明螢光顯微鏡。

對於光柵型結構光照明螢光顯微鏡,通過設計光柵的光柵常數、占空比、調製深度等結構參數，增強±1級衍射光的強度，從而提高獲取的高頻信息的強度，簡化裝置光路。但是，採用機械的方式來控制光柵旋轉和位移的裝置複雜，轉換速度較低；不同激發波長對應的±1 級衍射角是不一樣的，波長改變時需要微調光路，這為多色螢光激髮帶來不便。

空間光調製器型

為了避免用機械控制來改變結構條紋的相位和方向，可使用空間光調製器來產生結構光。光纖出來的光準直之後經過偏振分束器(PBS)、半波片(HWP)射入空間光調製器發生衍射，衍射光經過一個由兩片鐵電液晶相位延遲器(FLC)和一片四分之一波片(QWP)組成的偏振旋轉裝置，光路中的掩膜只允許±1 級衍射光進入後續光路並聚焦於物鏡的後焦面，經過物鏡重新變為平行光，兩束光在樣品表面發生干涉，產生餘弦結構光照明樣品，樣品發出的螢光經過分色鏡在CCD 上成像。

利用空間光調製器可以使結構條紋產生和控制的速度和精度得到提高，可以用於活體細胞成像。空間光調製器只能對偏振光進行調製的特點，使得光路略顯複雜；激發光偏離空間光調製器工作波長越大，衍射效率越低，因此空間光調製器對應特定的單個激發波長。

DMD型

這類結構光照明螢光顯微鏡利用DMD（數字微鏡晶片）產生用於照明的結構條紋。該結構光照明螢光顯微鏡整體光路簡單，在DMD 之後加入一個鏡筒透鏡將DMD 上的預設條紋成像於樣品表面，完成結構光的照明。DMD 由一系列微反射鏡組成(13 μm ×13 μm )，通過改變微鏡的偏轉角度實現微鏡的開關。微鏡的開關狀態可以通過計算機控制實現，精度高，且開關狀態可以進行高速切換。

利用DMD 搭建的結構光照明螢光顯微鏡光路可以快速產生結構條紋，並進行精確控制，可實現生物樣品的實時動態成像。DMD 利用反射原理產生結構光，它對寬光譜的入射光都具有較高的反射率，可以實現多波長激發。

優勢與發展

基於受激發射損耗螢光顯微術(stimulated emission depletion，STED)和基於單分子開關的超高解析度定位技術(包括光激活定位顯微成像術 (photoactivated localization microscopy，PALM)和隨機光學重建顯微法(stochastic optical reconstruction microscopy，STORM))的超高解析度成像可以得到更高的解析度，但它們的缺點也很明顯：需要很強的激發光來照明樣品。通常地球上的生物體受到的太陽的輻射在0.1 W/cm，而STED和PALM/STORM通常所需要的輻射在10~10W/cm，相當於一千個到一億個太陽的照射。在這種情況下，螢光蛋白/分子很快就被漂白，產生大量的自由基損傷細胞樣品。因此，本質上 STED 和 PALM/STORM 類型的超高解析度成像不適合活細胞長時間成像，而比較適合於死細胞和固定樣本的成像。相對應的，SIM 成像的方法非常有效地利用螢光分子所發出的光子，有可能成為活細胞超高解析度成像的利器。

Eric Betzig 教授的團隊和中國科學院生物物理研究所、美國國立科學研究院和哈佛醫學院等的科學家們合作探索, 發展了新型的SIM成像技術，使活細胞超高解析度成像成為現實。

套用

SIM的主要套用領域涉及光學切片、超解析度成像、表面輪廓成像，以及相位成像四個方面。

光學切片

由於生物樣品通常較厚，使用普通的光學顯微手段難以獲得其清晰的全貌，因此發展出了使用光學切片成像重構三維樣品全貌的技術手段。SIM採用的光學和計算技術的組合方法，可實現具有如寬視場成像以及更低的光毒性等優點的光學切片。

通過三維結構光照明方法可以獲得樣品在不同切層上的層析圖像，從而重構出3D圖像。

超解析度成像

利用SIM，科學家可以觀察到常規螢光顯微鏡無法分辨的細節信息。通過使用3D-SIM觀察細胞，可以獲得細胞器結構等亞細胞結構的超解析度圖像。

為了進一步提高解析度，可使用非線性SIM。已有報導將只需要較低能量就能產生非線性效應的可逆光開關螢光蛋白運用於非線性結構光照明螢光顯微鏡，並用它觀察哺乳動物的核膜孔和肌動蛋白細胞骨架，解析度達到60 nm。

表面輪廓成像

在表面成像領域裡，經常使用的掃描隧道顯微鏡（STM）、原子力顯微鏡（AFM）、掃描電子顯微鏡（SEM）等非光學顯微技術雖然具有更高的解析度，但其成像速度通常較慢。

利用3D-SIM，通常採用正弦條紋結構光照射樣品後，通過投影採集、邊緣分析、相位展開與校準等步驟，亦可獲得較高解析度的表面圖像。

相位成像

使用SIM採集相位物體的圖像之後，通過相位重構以及相位擴展，亦可獲得具有較高解析度的相點陣圖像。

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