受激發射損耗螢光顯微術

突破光學衍射極限的辦法之一是近場光學顯微鏡，它是利用探針探測樣品表面的隱失場而獲得樣品表面信息。

受激發射損耗（STED）螢光顯微術是一種可以突破光學衍射極限的遠場光學顯微術。

基本介紹

• 中文名：受激發射損耗螢光顯微鏡
• 外文名：Stimulated Emission Depletion Microscopy（STED）
• 專業：遠場光學顯微術

背景

隨著科學技術的不斷進步，生物醫學，材料學領域開始對亞百納米尺度的微結構進行觀測與分析，從而對顯微技術的發展提出了更高的要求。然而，由於衍射極限的存在，常規光學顯微術的解析度一般被限制在半波長左右，無法滿足對於徽納尺度觀測的需求。雖然隨著掃描電鏡、掃描隧道顯微鏡及原子力顯微鏡等技術的出現，實現納米量級的解析度已經成為可能，但是以上這些技術仍然存在對樣品破壞性較大，只能觀測樣品表面等缺點，並不適合對於生物樣品，特別是活體樣品的觀測。因此，研究人員們急需找到一種光學的超衍射極限顯微方法。二十世紀九十年代以來，研究人員們陸續提出了多種超分辨顯微技術來實現超越衍射極限的高解析度。在這些方法之中，以德國科學家S．W．Hell在1994年提出的受激發射損耗顯微術(Stimulated Emission Depletion Microscopy，STED）的發展最為成熟，套用也最為廣泛。

受激發射損耗顯微術的基本原理

在常規光學顯微系統當中，由於光學元件的衍射效應，平行入射的照明光經過顯微物鏡聚焦之後在樣品上所成的光斑並不是一個理想的點，而是一個具有一定尺寸的衍射斑。在該衍射斑範圍之內的樣品均會由於被照明光照射而發出螢光，使得該範圍內的樣品細節信息沒有辦法被分辨，從而限制了顯微系統的分辨能力。為了突破衍射極限的限制，實現超分辨顯微，如何減小在單個掃描點處的有效螢光發光面積便成為了關鍵。

在STED顯微術中，有效螢光發光面積的減小是通過受激發射效應來實現的。一個典型的STED顯微系統中需要兩束照明光，其中一束為激發光，另外一束為損耗光。當激發光的照射使得其衍射斑範圍內的螢光分子被激發，其中的電子躍遷到激發態後，損耗光使得部分處於激發光斑外圍的電子以受激發射的方式回到基態，其餘位於激發光斑中心的被激發電子則不受損耗光的影響，繼續以自發螢光的方式回到基態(如圖1所示)。由於在受激發射過程中所發出的螢光和自發螢光的波長及傳播方向均不同，因此真正被探測器所接受到的光子均是由位於激發光斑中心部分的螢光樣品通過自發螢光方式產生的。由此，有效螢光的發光面積得以減小，從而提高了系統的解析度。

圖1 STED顯微術基本超分辨原理

STED顯微術能實現超分辨的另一個關鍵在於受激發射與自發螢光相互競爭中的非線性效應。當損耗光照射在激發光斑的邊緣位置使得該處樣品中的電子發生受激發射作用時，部分電子不可避免地仍然會以自發螢光的方式回到基態。然

圖2 受激發射過程中的非線性效應

而當損耗光的強度超過某一閾值之後，受激發射過程將出現飽和，此時以受激發射方式回到基態的電子將占絕大多數，而以自發螢光方式回到基態的電子則可以忽略不計(如圖2所示)。因此，通過增大損耗光的強度，使得激發光斑範圍內更多範圍的自發螢光被抑制，可以提高STED顯微術的解析度。

STED系統組成

一個典型的STED顯微成像系統主要由以下幾個部分組成：超連續雷射器、共聚焦顯微鏡、納米平移台、APD探測器、時間相關的單光子計數器(TCSPC)及分析軟體。如圖3所示，激發光經過光學系統後,在物鏡焦平面上形成一個艾里斑。STED光經過一個螺旋線狀相位板的調製後,具有exp(iψ󰀁)相位延遲，在焦平面干涉形成一個環狀光圈。這個光圈和激發光的艾里斑相疊加後，限定了只有位於光圈中心的螢光物質可以激發出螢光,這個螢光發光斑點遠遠低於衍射極限,其峰值半峰全寬可以達到16nm。

圖3 STED顯微鏡原理示意圖

STED顯微鏡的解析度主要是由有效螢光光斑的大小及損耗效果決定的。可以通過各種措施改善STED光在焦平面相干形成的抑制光圈的干涉對比度及中心強度分布，通過改善影響相干的條件，壓縮螢光光斑的大小，儘可能提高橫向和軸向抑制比。影響相干抑制的因素有STED光的光強、偏振態和脈寬,激發光的強度和脈寬、相位板以及系統像差和脈衝延遲，可通過相關的措施改善抑制效果，提高系統的解析度。

受激發射損耗顯微術的關鍵技術

損耗光斑的調製

在STED顯微系統之中，為了減小有效螢光的發光面積，需要使得經顯微物鏡聚焦後所得的損耗光斑的光強分布滿足以下特性：在激發光斑的邊緣部分具有較大的光強抑制自發螢光的產生，同時在激發光斑的中心部分具有趨近於零的低光強，對自發螢光不產生影響。為了實現這一效果，需要對入射的損耗光束進行相應的調製。

激發光與損耗光雷射類型的選擇

常用的雷射器有脈衝光和連續光兩種類型。 在STED顯微術剛被提出的時候，所有的STED系統都是基於脈衝光源來搭建的，其主要原因有以下兩點：(1)採用脈衝光源使得激發光和損耗光在時域上具有可分離性，使得受激發射損耗的消光過程更便於操控；(2)由於STED的顯微術的解析度隨著所用損耗光光強的增加而提高，在相同的平均功率下，脈衝光具有比連續光更高的峰值光強。

而目前可用於STED系統的雷射光源類型組合為：(1)脈衝激發光和脈衝損耗光；(2)脈衝激發光和連續損耗光；(3)連續激發光和連續損耗光。

激發光與損耗光波長的選擇

在一個典型的STED顯微系統中，激發光和損耗光波長的選擇需要滿足以下原則：激發波長應選在所用螢光粉激發譜的峰值波長附近，以保證較好的吸收；損耗光波長應選在所用螢光粉發射譜的長波拖尾處，以避免損耗光對樣品的二次激發。

因此，目前主流STED顯微系統中仍然將損耗光波長選擇在發射譜的長波拖尾處。對於損耗光波長的改進還有待後續的研究。

套用

從1994年至今，STED技術經過了近20年的發展，已經變得越來越完善，同時也在多個領域中得到了套用。

STED最為基本的套用是對螢光樣品的強度分布進行成像。目前，STED顯微術已經成功實現了對於螢光納米顆粒，螢光標記的生物細胞等樣品進行強度成像。通過將STED成像效果和常規共焦顯微術(Confocal)的成像效果進行對比可以發現，STED技術對於解析度有一個明顯的提升，更多的樣品細節可以被STED顯微術解析出來。

除了對於靜態樣品進行觀測之外，STED技術還可以套用於活體樣品的成像之中實現超衍射極限的解析度。

STED技術還可用於對螢光樣品進行螢光壽命測量(FLIM)及螢光相關譜測量(FCS)，從而使得STED系統成為了一種多功能超分辨成像系統，在生物醫學等領域中的套用也變得更加廣泛。

除了在成像領域的套用之外，STED超分辨的思想在微細結構的光刻，超高密度的存儲等領域也有廣泛的套用，為材料學等領域的發展也做出了重要的推進作用。

結論

󰀁受激發射損耗顯微術(STED)是一種有效的光學超分辨方法。通過引入一束損耗光以受激發射的方式來抑制有效螢光的發射，STED可以實現超衍射極限的解析度。自1994年被提出以來，STED技術經過各方面的改進與發展，正在變得日益的完善與成熟。同時，STED顯微術在生物醫學、材料學等領域中的多功能套用也推動了這些領域的快速發展。