基本介紹
- 中文名：氯化三苯基四氮唑法
- 測定）：根系活力（TTC法
- 氧化還原電位：為80mV
- 試劑：乙酸乙酯
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測定根系
原理
氯化三苯基四氮唑，生成的TTF比較穩定，不會被空氣中的氧自動氧化，所以TTC被廣泛地用作酶試驗的氫受體，植物根所引起的TTC還原，可因加入琥珀酸、延胡索酸、蘋果酸得到增強，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC還原量能表示脫氫酶活性，並作為根系活力的指標。儀器與用具?? 分光光度計；分析天平（感量0.1mg）；恆溫箱1台；研缽1套；100ml三角瓶；漏斗；移液管10ml 1支、2ml 1支、0.5ml 1支；20ml刻度試管；10ml容量瓶；小培養皿；試管架，藥匙；石英砂適量。
試劑
乙酸乙酯；
連二亞硫酸鈉（Na2S2O4，為強還原劑，俗稱保險粉）；
1%TTC溶液：準確稱取TTC 1.0g，溶於少量蒸餾水中，定容至100ml；
0.4%TTC溶液：準確稱取TTC 0.4g，溶於少量蒸餾水中，定容至100ml；
磷酸緩衝液（1/15mol/L，pH7.0）；
方法
1.定性測定
（2）把根仔細洗淨，把地上部分從莖基切除，將根放入三角瓶中，倒入反應液，以浸沒根為度，置37℃左右暗處放1h，以觀察著色情況，新根尖端幾毫米以及細側根都明顯地變成紅色，表明該處有脫氫酶存在。
2.定量測定
（1）TTC標準曲線的製作
吸取0.25ml 0.4%TTC溶液放入10ml容量瓶，加少許Na2S2O4粉末，搖勻後立即產生紅色的TTF。再用乙酸乙酯定容至刻度，搖勻。然後分別取此液0.25ml、0.5ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TTF25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的標準比色系列，以空白作參比，在485nm波長下測定光密度，繪製標準曲線。
（2）稱取根樣品0.5g，放入小培養皿（空白試驗先加硫酸再加入根樣品，其他操作相同），加入0.4%TTC溶液和磷酸緩衝液的等量混合液10ml，把根充分浸沒在溶液內，在37℃下暗處保溫1h，此後加入1mol/L硫酸2ml，以停止反應。
（3）把根取出，吸乾水分後與乙酸乙酯3~4ml和少量石英砂一起磨碎，以提出TTF。把紅色提出液移入試管，用少量乙酸乙酯把殘渣洗滌二至三次，皆移入試管，最後加乙酸乙酯使總量為10ml，用分光光度計在485nm下比色，以空白作參比讀出光密度，查標準曲線，求出四氮唑還原量。
（4）計算
將所得數據帶入下式，求出四氮唑還強度。
種子測定
原理
有生活力的種子能夠進行呼吸代謝，在呼吸代謝途徑中由脫氫酶催化所脫下來?的氫酶催化所脫下來的氫可以將無色的2,3,5-三苯基氯化四唑還原為紅色、不溶性的甲臢，而且種子的生活力越強，代謝活動越旺盛，被染成紅色的程度越深，死亡的種子由於沒有呼吸作用，因而不會將TTC還原為紅色。種胚生活力衰退或者部分喪失生活力，則染色較淺或局部被染色。因此，可以根據種胚染色的部位以及染色的深淺程度來判定種子的生活力。
試劑
0.5%TTC溶液；TTC溶液最好隨用隨配，不宜久藏。溶液應遮光貯藏。若已經變為紅色，則不能繼續使用。
方法
1.浸種
將種子用溫水（30～?35℃?）浸泡2～6h，使種子充分吸脹。
2.顯色
隨機取吸脹種子20粒，小心剝去種皮，務必不要傷害種胚。然後將處理好的種子置於小白瓷碗中，加入0.5%TTC溶液，以剛好浸沒水中煮5min後，再加入0.5%TTC溶液染色。
3.統計
染色結束後要立即進行鑑定，因放置太久會褪色。倒出TTC溶液，再用清水將種子沖洗1～2次，觀察種胚被染色的情況。凡種胚全部或大部分被染成紅色的即為具有生活力的種子，種胚不被染色的為死種子。根據上述標準鑑定煮沸和未煮沸種子的生活力。
花粉測定
原理
根據有活力的花粉粒在呼吸過程中產生氧化還原反應，無活力的花粉粒無此反應。當TTC滲入有活力的花粉粒內，並作為氫受體被脫輔酶上的氫還原時，便由無色的氯化三苯四氮唑（TTC）變為紅色的三苯基甲唑（TTF）（適用作新鮮花粉經乾燥等加工處理後的活力指標，對陳舊不新鮮的花粉，這一指標的變化另當別論）。
試劑
0.5%TTC溶液（稱取TTC 0.5克放入燒杯中加入少許95%酒精使用溶解，然後用蒸餾水稀釋至100毫升。溶液避光保存，溶液發紅時，不能再用）
方法
2.將製片放入30℃恆溫箱中放置15分鐘。然後在顯微鏡下觀察。凡被染為紅色的活力強；淡紅色的次之；無色者沒有活力的花粉。
3.觀察2~3個製片，每片取5個視野，統計100粒，然生計算花粉的活力百分率。
