四氮唑比色法

皮質激素類的C17位的α-醇酮基具有還原性．在強鹼性溶液中能將四氮唑鹽定量地還原為有色甲噆(formazan)，後者在可見光區有最大吸收。

原理

該反應在一定條件下可定量完成，且生成的有色甲臢具有一定的穩定性，可用於甾體激素類藥物的含量測定。

四氮唑鹽的種類

最常用的四氮唑鹽有兩種：

(1)2，3，5-三苯基氮化四氮唑(2，3，5-triphenyltetramlium chloride，縮寫為TTC)，簡稱為氯化三苯四氮唑或紅四氮唑(red tetramline，RT)，其還原產物為不溶於水的深紅色三苯甲簪，在480~490nm波長處有最大吸收。氯化三苯四氮唑顯色靈敏度較低，但空白吸收較小。

(2)藍四氮唑(blue tetramline，BT)，即3，3’-二甲氧苯基-雙4，4’-(3，5-二苯基)氮化四氮唑{3，3’-dianisole-bis[4，4’-(3，5-diphenyl)tetramlium chloride]}，其還原產物為暗藍色的雙甲簪，在525nm波長處有最大吸收。

套用示例

以中國藥典收載的醋酸氫化可的鬆軟膏的含量測定為例，測定方法如下：

對照品溶液的製備

精密稱取醋酸氫化可的松對照品25mg，置100ml量瓶中，加無水乙醇適量使溶解，並稀釋至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液的製備

精密稱取本品2.5g(相當於醋酸氫化可的松25mg)，置燒杯中，加無水乙醇約30ml，置水浴加熱使溶解，再置冰水中冷卻，濾過，濾液置100ml量瓶中，如此提取3次，濾液併入量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

測定

精密量取對照品溶液與供試品溶液各1ml，分別置乾燥具塞試管中，各精密加無水乙醇9ml與氯化三苯四氮唑試液(取氯化三苯四氮唑lg，加無水乙醇使溶解成200ml)lml，搖勻，再各精密加氫氧化四甲基銨試液(取10%氫氧化四甲基銨溶液lml，加無水乙醇使成10ml)1ml，搖勻，在25℃的暗處放置40~45分鐘，照分光光度法，在485nm的波長處分別測定吸收度，計算即得。

討論

本法廣泛用於皮質激素類的測定，但當藥物被分解破壞(C17-α-醇酮基被氧化)後即無此反應。所以分解產物對本法無干擾，但在測定過程中受到各種因素的影響，如反應溫度和時間、水分、PH值、氧和光線等。

溫度與時間的影響

呈色速度一般隨溫度增高而加快，但在室溫或30℃恆溫條件下顯色易得重現性較好的結果，反應時間視供試品和試劑的種類不同而異。中國藥典多數在25℃暗處反應40~45分鐘。

取代基的影響

反應原理是C21-羥基被四氮唑氧化，當C21-羥基酯化後，其反應速度較C21-羥基游離時的反應速度慢；酯化的醯基結構越複雜則反應速度越慢。

空氣及光線的影響

反應及其產物對光及氧敏感，因此必須用避光容器並置於暗處顯色，同時在達到最大呈色時間後，立即測定吸收度。TTC法形成的產物對空氣中氧敏感．顯著影響顏色的強度和穩定性，因此英國藥典規定在加入試劑後要往容器中充氮氣。

溶劑和水分的影響

多數採用95%的乙醇，但有時為了減少整個反應液中水分的含最則採用無水乙醇。含水量過大會使呈色速度減慢，含水量不超過5%時．對結果幾乎無影響。醇中的醛類雜質必須除去，因為少量乙醛會使吸收度增高，故一般使用無醛醇作為溶劑。

鹼的種類和濃度

目前最常用的是氫氧化四甲基銨，能得到滿意結果。一般用甲醇或乙醇將10%的氫氧化四甲基銨溶液稀釋後再用，反應完畢後溶液中鹼的濃度通常約為0.01mol/L。

干擾物的影響

有些還原性物質如抗壞血酸、還原糖、硫醇、多元酚等都能與四氮唑鹽反應而引起干擾，但在甾體激素原料和製劑的分析中不易遇到。某些賦形劑如聚乙二醇、丙二醇、羊毛脂對BT法有較顯著的干擾，山梨醇和角鯊烯也有干擾，因此，測定油膏、冷霜等製劑時必須先分離才能測定。