基本介紹
試驗原理,連續梯度,不連續梯度,有機溶劑抽提,溴化乙錠溶液的淨化處理,溴化乙錠希溶液的淨化處理,從質粒DNA製品中去除RNA,
試驗原理
大量提取的質粒DNA一般需進一步純化,常用柱層析法和氯化銫梯度離心法。常使用的所有純化方法都利用了質粒DNA相對較小及共價閉合環狀這樣兩個性質。例如，用氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心分離質粒和染色體DNA就取決於溴化乙錠與線狀以及與閉環DNA分子的結合量有所不同。溴化乙錠通過嵌入鹼基之間而與DNA結合，進而使雙螺旋解旋。由此導致線狀DNA的長度有所增加，作為補償，將在閉環質粒DNA中引入超螺旋單位。最後，超螺旋度大為增加，從而阻止了溴化乙錠分子的繼續嵌入。但線狀分子不受此限，可繼續結合更多溴化乙錠，直至達到飽和(每2個鹼基對大約結合1個溴化乙錠分子)。由於染料的結合量有所差別，線狀和閉環DNA分了在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫度中的浮力密度也有所不同。多年來，氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心已成為製備大量質粒DNA的首選方法。然而該過程既昂貴又費時，為此發展了許多替代方法。其中主要包括利用離子交換層析、凝膠過濾層析、分級沉澱等分離質粒DNA和宿主DNA的方法。儘管這些方法大多數均被束之高閣，但其中最好的方法，也應是聚乙二醇分級沉澱法，最近已得到改進（R.Treisman,個人通訊）並達到較高境界，使用該方法可得到極高純度的質粒。聚乙二醇分級沉澱法與氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心法有一點不同，那就是不能有效地把帶切口的環狀分子同閉環質粒DNA分開，因此，純化容易帶上切口的極大質粒（大於15kb）及用於生物物理學測定的閉環質粒時、平衡離心仍是首選的方法。然而，兩種純化方法都可得到足可勝任分子克隆中各種複雜工作的質粒DNA，包括用於哺乳動物細胞的轉染以及利用外切核酸酶產生成套的缺失突變體。
氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心法純化閉環DNA
氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心法純化閉環DNA
連續梯度
1、測量DNA溶液的體積，按lg/ml的用量精確地加入固體CsCl,將溶液加溫至30℃助溶。溫和地混勻溶液直到鹽溶解。
2、每10mlDNA溶液加入0.8ml溴化乙錠溶液（10mg/ml溶於水）；立即將溴化乙錠溶液（漂浮在表層）與DNA－氯化銫溶液混勻，溶液的終密度應為1.55g/ml（溶液的折射率為1.3860）溴化乙錠濃度大約740μg/ml。【溴化乙錠貯存液應貯存於避光容器內（如用錫箔完全包裹的瓶子），於室溫保存。
3、室溫下用SorvallSS34頭（或與其相當的轉頭）以8000rpm離心5min，浮在溶液上面的水垢狀浮渣是溴化乙錠和細菌蛋白所形成的複合物。
4、用巴斯德吸管或帶大號針頭的一次性注射器將浮渣下的清亮紅色溶液轉移到離心管中。用輕石蠟油加滿管的其餘部分並封口。
5、以20℃對所得的密度梯度以45000rpm離心16h（VTi65轉頭）、以45000rpm離心48h（Ti50轉頭）、以60000rpm離心24h（Ti65轉頭）或者以60000rpm離心24h（Ti70.1轉頭）。普通光照下，在梯中心可見兩條DNA區帶，上部區帶材料通常較少，由線狀的細菌（染色體）DNA和帶切口的環狀質粒DNA組成：下部區帶則由閉環質粒DNA組成。管底部深紅色的沉澱是溴化乙錠RNA複合物，位於CsCl溶液和石蠟油之間的是蛋白質。BeckmanQuick-Seal離心管中的CsCl－溴化乙錠梯度可容納4mg閉環質粒DNA而不至超負荷。如有更大量的質粒存在，將擴展為一條寬頻，並與染色體DNA相重疊。這種問題只有在質粒複製達到極高水平時才會出現，只要將該質粒提取物分為2個梯度即可解決。如出現負荷，可收集整個DNA區高產水平時才會出現，只要將該質粒提取物分為2個梯度即可解決。如出現超負荷，可收集整個DNA區帶，用CsCl溶液（ρ=1.58g/ml）將體積調到15ml，在兩個離心管中再度離心，使DNA達到平衡。
6、收集DNA帶。將21號皮下注射針頭插入管的頂端以使空氣進入，為儘量減少污染的機會，首先用18號皮下注射針頭按下述方法收集上部的區帶（雜色體DNA）：用乙醇小心擦拭管外壁以除去任何油脂，然後將一塊Soctch膠帶貼於管外壁。穿過Soctch膠帶將18號皮下注身針頭（其斜面向上）插入管中，以便使針頭的斜面開口恰好位於染色體DNA區帶之下並與該區帶相平行。將粘稠狀DNA收集到一次性使用的管內，用造型粘土塊封住皮下注射針頭的末端並將第2根針頭留於原處。穿過Soctch膠帶插入第3根皮下注射針頭（18號），將下部的質粒DNA區帶收集到玻璃或塑膠管中。
2、每10mlDNA溶液加入0.8ml溴化乙錠溶液（10mg/ml溶於水）；立即將溴化乙錠溶液（漂浮在表層）與DNA－氯化銫溶液混勻，溶液的終密度應為1.55g/ml（溶液的折射率為1.3860）溴化乙錠濃度大約740μg/ml。【溴化乙錠貯存液應貯存於避光容器內（如用錫箔完全包裹的瓶子），於室溫保存。
3、室溫下用SorvallSS34頭（或與其相當的轉頭）以8000rpm離心5min，浮在溶液上面的水垢狀浮渣是溴化乙錠和細菌蛋白所形成的複合物。
4、用巴斯德吸管或帶大號針頭的一次性注射器將浮渣下的清亮紅色溶液轉移到離心管中。用輕石蠟油加滿管的其餘部分並封口。
5、以20℃對所得的密度梯度以45000rpm離心16h（VTi65轉頭）、以45000rpm離心48h（Ti50轉頭）、以60000rpm離心24h（Ti65轉頭）或者以60000rpm離心24h（Ti70.1轉頭）。普通光照下，在梯中心可見兩條DNA區帶，上部區帶材料通常較少，由線狀的細菌（染色體）DNA和帶切口的環狀質粒DNA組成：下部區帶則由閉環質粒DNA組成。管底部深紅色的沉澱是溴化乙錠RNA複合物，位於CsCl溶液和石蠟油之間的是蛋白質。BeckmanQuick-Seal離心管中的CsCl－溴化乙錠梯度可容納4mg閉環質粒DNA而不至超負荷。如有更大量的質粒存在，將擴展為一條寬頻，並與染色體DNA相重疊。這種問題只有在質粒複製達到極高水平時才會出現，只要將該質粒提取物分為2個梯度即可解決。如出現負荷，可收集整個DNA區高產水平時才會出現，只要將該質粒提取物分為2個梯度即可解決。如出現超負荷，可收集整個DNA區帶，用CsCl溶液（ρ=1.58g/ml）將體積調到15ml，在兩個離心管中再度離心，使DNA達到平衡。
6、收集DNA帶。將21號皮下注射針頭插入管的頂端以使空氣進入，為儘量減少污染的機會，首先用18號皮下注射針頭按下述方法收集上部的區帶（雜色體DNA）：用乙醇小心擦拭管外壁以除去任何油脂，然後將一塊Soctch膠帶貼於管外壁。穿過Soctch膠帶將18號皮下注身針頭（其斜面向上）插入管中，以便使針頭的斜面開口恰好位於染色體DNA區帶之下並與該區帶相平行。將粘稠狀DNA收集到一次性使用的管內，用造型粘土塊封住皮下注射針頭的末端並將第2根針頭留於原處。穿過Soctch膠帶插入第3根皮下注射針頭（18號），將下部的質粒DNA區帶收集到玻璃或塑膠管中。
不連續梯度
該方法是將含不同濃度CsCl的溶液分層加到離心管中，這樣可以加速CsCl梯度的形成，使離心時間減少到6h。
1、將125gCsCl加到167ml(pH8.0)中，製成CsCl溶液（ρ=1.47g/ml）。
2、將8ml氯化銫溶液加到BeckmanQuick-Seal離心管（或與其相當的管）中，待用。
3、如有必要，可酌情用TE(pH8.0)將質粒DNA溶液的體積精確地調到3ml。
4、在質粒DNA溶液中加入8.4gCsCl,將溶液加溫至30℃以促進鹽溶解，小心地混勻溶液直至鹽溶解。
5、稱量溶液重量並加入TE(pH8.0)直到溶液重量恰好達13.2g，用天平稱量時應注意去除管的重量。
6、加入0.8ml溴化乙錠溶液（10mg/ml溶於水），快速混勻溶液直至染料均勻地分散，此時溶液瓣體積應大約為7.5ml。小心：溴化乙錠是一咱強誘變劑，並有中度毒性。接觸含有該染料的溶液應戴手套。【溴化乙錠貯存液應貯存於避光容器內（如用錫箔完全包裹的瓶子），於室溫保存。】
7、室溫下，用SorvallSS34轉頭（或與之相當的轉法）以8000rpm離心5min，浮在液面上的水垢狀浮渣是溴化乙2錠和細菌蛋白所形成的複合物。
8、將22.86cm的巴期德吸管放入裝有CsCl（步驟b製備）的離心管中，吸頭應接觸管底。用吸管小心地將步驟g所製備的清亮紅色溶液（來自浮渣之下）加入管內，使樣本層位於CsCl溶液（1.47g/ml）之下。如有必要，可酌情將步驟a中製備的CsCl溶液（ρ=1.47g/ml)添滿離心管，封口。
9、將封口的管，（與相應的平衡管一起）放入BeckmanTi70.1或Sorvall65.13轉頭（或與之相當的轉頭中），於20℃以60000rpm度離心6h。
10、回收閉環質粒DNA區帶。
從經過純化的質粒DNA中去除溴化乙錠
溴化乙錠是一種強誘變劑，並有中度毒性。接觸含有該染料的溶液應戴手套。
1、將125gCsCl加到167ml(pH8.0)中，製成CsCl溶液（ρ=1.47g/ml）。
2、將8ml氯化銫溶液加到BeckmanQuick-Seal離心管（或與其相當的管）中，待用。
3、如有必要，可酌情用TE(pH8.0)將質粒DNA溶液的體積精確地調到3ml。
4、在質粒DNA溶液中加入8.4gCsCl,將溶液加溫至30℃以促進鹽溶解，小心地混勻溶液直至鹽溶解。
5、稱量溶液重量並加入TE(pH8.0)直到溶液重量恰好達13.2g，用天平稱量時應注意去除管的重量。
6、加入0.8ml溴化乙錠溶液（10mg/ml溶於水），快速混勻溶液直至染料均勻地分散，此時溶液瓣體積應大約為7.5ml。小心：溴化乙錠是一咱強誘變劑，並有中度毒性。接觸含有該染料的溶液應戴手套。【溴化乙錠貯存液應貯存於避光容器內（如用錫箔完全包裹的瓶子），於室溫保存。】
7、室溫下，用SorvallSS34轉頭（或與之相當的轉法）以8000rpm離心5min，浮在液面上的水垢狀浮渣是溴化乙2錠和細菌蛋白所形成的複合物。
8、將22.86cm的巴期德吸管放入裝有CsCl（步驟b製備）的離心管中，吸頭應接觸管底。用吸管小心地將步驟g所製備的清亮紅色溶液（來自浮渣之下）加入管內，使樣本層位於CsCl溶液（1.47g/ml）之下。如有必要，可酌情將步驟a中製備的CsCl溶液（ρ=1.47g/ml)添滿離心管，封口。
9、將封口的管，（與相應的平衡管一起）放入BeckmanTi70.1或Sorvall65.13轉頭（或與之相當的轉頭中），於20℃以60000rpm度離心6h。
10、回收閉環質粒DNA區帶。
從經過純化的質粒DNA中去除溴化乙錠
溴化乙錠是一種強誘變劑，並有中度毒性。接觸含有該染料的溶液應戴手套。
有機溶劑抽提
用後溶液套用下面的步驟進行淨化處理。
1、將DNA溶液放入玻璃或塑膠管中，加等體積的水飽和1－丁醇或異戊醇。
2、振盪混合兩相。
3、用台式離心機,室溫下以1500rpm，離心3min。
4、用巴期德吸管將下層水相移至一乾淨的玻璃或塑膠管內。
5、反覆抽提[步驟a－d]4－6次直到粉紅色從水相和有機相中均消失。
6、用以下任意一種方法從DNA溶液中除去CsCl：通過微量濃縮器（Amicon）進行旋轉透析，對TE(pH8.0)透析24-48h，並換液數次或者用3倍體積水進行稀釋並於4℃用2倍體積乙醇（即終體積相當於原未稀釋體積的6倍）沉澱15min，再以4℃，10000rpm離心15min，將沉澱的DNA溶於約1mlTE(pH8.0)中。如果將DNA的乙醇溶液置於-20℃，CsCl會沉澱。
7、測定DNA最終溶液的OD260值，計算DNA的濃度，將DNA分成小份貯存於-20℃。如果製備的DNA含有顯著量的溴化乙錠（依顏色判斷），可用酚、酚：氯仿各抽提1次，然後用乙醇沉澱DNA。
1、將DNA溶液放入玻璃或塑膠管中，加等體積的水飽和1－丁醇或異戊醇。
2、振盪混合兩相。
3、用台式離心機,室溫下以1500rpm，離心3min。
4、用巴期德吸管將下層水相移至一乾淨的玻璃或塑膠管內。
5、反覆抽提[步驟a－d]4－6次直到粉紅色從水相和有機相中均消失。
6、用以下任意一種方法從DNA溶液中除去CsCl：通過微量濃縮器（Amicon）進行旋轉透析，對TE(pH8.0)透析24-48h，並換液數次或者用3倍體積水進行稀釋並於4℃用2倍體積乙醇（即終體積相當於原未稀釋體積的6倍）沉澱15min，再以4℃，10000rpm離心15min，將沉澱的DNA溶於約1mlTE(pH8.0)中。如果將DNA的乙醇溶液置於-20℃，CsCl會沉澱。
7、測定DNA最終溶液的OD260值，計算DNA的濃度，將DNA分成小份貯存於-20℃。如果製備的DNA含有顯著量的溴化乙錠（依顏色判斷），可用酚、酚：氯仿各抽提1次，然後用乙醇沉澱DNA。
溴化乙錠溶液的淨化處理
溴化乙錠是強誘變劑，並有中度毒性，取用含有這一染料的溶液時務必戴上手套，這些溶液經使用應按下面介紹的方法進行淨化處理。
溴化乙錠濃溶液（即濃度>0.5gm/ml的溴化乙錠沉溶液）的淨化處理：
用沙門氏菌－微粒體測定表明，本方法（Lunn和Sanaone,1987）可使溴化乙錠的誘變活性降低至原來的1/200左右。
1、加入足量的水使溴化乙錠的濃度降低至0.5mg/ml以下。
2、加入0.2體積新配製的5%次磷酸和0.12體積新配製的0.5mol/L亞硝酸鈉，混勻。【檢測該溶液的pH值應小於3.0。市售次磷酸一般為50%溶液，具有腐蝕性，應小心操作，必須現用現稀釋。亞硝酸鈉溶液（0.5mol/L）套用水溶解34.5g亞硝酸鈉並定容至終體積500ml，現用現配。】
3、於室溫溫育24h後，加入大大過量的1mol/L碳酸氫鈉。至此，該溶液可予丟棄。
溴化乙錠濃溶液（即濃度>0.5gm/ml的溴化乙錠沉溶液）的淨化處理：
用沙門氏菌－微粒體測定表明，本方法（Lunn和Sanaone,1987）可使溴化乙錠的誘變活性降低至原來的1/200左右。
1、加入足量的水使溴化乙錠的濃度降低至0.5mg/ml以下。
2、加入0.2體積新配製的5%次磷酸和0.12體積新配製的0.5mol/L亞硝酸鈉，混勻。【檢測該溶液的pH值應小於3.0。市售次磷酸一般為50%溶液，具有腐蝕性，應小心操作，必須現用現稀釋。亞硝酸鈉溶液（0.5mol/L）套用水溶解34.5g亞硝酸鈉並定容至終體積500ml，現用現配。】
3、於室溫溫育24h後，加入大大過量的1mol/L碳酸氫鈉。至此，該溶液可予丟棄。
溴化乙錠希溶液的淨化處理
方法一：
1、每100ml溶液中加入2.9gAmberliteXAD－16，這是一種非離子型多聚吸附劑，可向Rohm和Haas公司購置。
2、於室溫下放置12h，不時搖動。
3、用Whatman1號濾紙過濾溶液，丟棄慮液。
4、用塑膠袋封裝濾紙和Amberlite樹脂，作為有害的廢物丟棄。
方法二：
1、每100ml溶液中加入100mg粉狀活性炭。
2、於室溫放置1h，不時搖動。
3、用Whatman1號濾紙過濾溶液，丟棄慮液。
4、用塑膠袋封裝濾紙和活性炭，作為有害的廢物丟棄。
1、每100ml溶液中加入2.9gAmberliteXAD－16，這是一種非離子型多聚吸附劑，可向Rohm和Haas公司購置。
2、於室溫下放置12h，不時搖動。
3、用Whatman1號濾紙過濾溶液，丟棄慮液。
4、用塑膠袋封裝濾紙和Amberlite樹脂，作為有害的廢物丟棄。
方法二：
1、每100ml溶液中加入100mg粉狀活性炭。
2、於室溫放置1h，不時搖動。
3、用Whatman1號濾紙過濾溶液，丟棄慮液。
4、用塑膠袋封裝濾紙和活性炭，作為有害的廢物丟棄。
從質粒DNA製品中去除RNA
對於某些用途（例如用BAL31進生活化或用T4噬菌體多核苷酸激酥標記質粒DNA的限制切片段的5'端），必須獲得無RNA污染的DNA製品。儘管在通過氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心所製備的質粒DNA中，這樣的RNA污染物的質量很少，但其中的RNA分子數卻可能相當可觀，並可在限制酶消化反應的全部5'端中占據較大的比例。通過下述方法，可以從質粒製品中去除RNA。通過Bio-GelA-150m或SepharoseCL-4B進行層析
1、製備質粒DNA。
2、有等體積的經TE(pH8.0)平衡後的酚抽提1次。
3、將至多1ml的水相鋪在經TE(pH8.0)和0.1%SDS平衡的Bio-GelA-150m或SepharaseCL-4B(1x10cm)柱上。
4、將DNA裝入層柱並在柱的上部連線上含0.1%SDS的TE(pH8.0)的貯液瓶，立即開始以0.5ml流出液為1流進行收集。
5、當收集到15份時，關閉柱底部，為明確質粒DNA的分布情況，可在每份收集物中取10μg樣品，通過0.7%瓊脂糖凝膠電泳或溴化乙錠螢光進行分析。
6、將含質粒DNA的組成合併在一起，加2倍體積的乙醇於4℃沉澱10min，然後以4℃大於10000rpm離心15min，以回收DNA。
1、製備質粒DNA。
2、有等體積的經TE(pH8.0)平衡後的酚抽提1次。
3、將至多1ml的水相鋪在經TE(pH8.0)和0.1%SDS平衡的Bio-GelA-150m或SepharaseCL-4B(1x10cm)柱上。
4、將DNA裝入層柱並在柱的上部連線上含0.1%SDS的TE(pH8.0)的貯液瓶，立即開始以0.5ml流出液為1流進行收集。
5、當收集到15份時，關閉柱底部，為明確質粒DNA的分布情況，可在每份收集物中取10μg樣品，通過0.7%瓊脂糖凝膠電泳或溴化乙錠螢光進行分析。
6、將含質粒DNA的組成合併在一起，加2倍體積的乙醇於4℃沉澱10min，然後以4℃大於10000rpm離心15min，以回收DNA。
