單鏈構象多態性分析

單鏈構象多態性分析

單鏈構象多態性(single strand conformation polymorphism,SSCP)分析是利用DNA或RNA單鏈構象具有多態性的特點,結合PCR技術進行基因檢測的一種分析技術,稱為PCR-SSCP技術,用以分析微生物的遺傳學特徵和基因突變。由於毛細血管電泳技術能在數十分鐘內將PCR擴增片斷分離出雙鏈及單鏈峰,僅有一個鹼基差異的兩條DNA也能得到較好的分離,說明毛細血管電泳技術用於PCR-CE-SSCP是一種快速、有效的篩選基因點突變的方法。採用細菌rRNA基因(16SrRNA 23SrRNA)分析,對微生物進行分類鑑定,對絕大多數血培養陽性分離株及分支桿菌屬細菌的鑑定,均顯示出良好的分辨效果。而且對結核分支桿菌的各種耐藥基因檢測,對喹諾酮類藥物耐藥決定區基因突變的檢測已成為常用的方法。如用限制性內切酶水解PCR片斷,還可進行限制性片斷長度多態性分析,PCR-CE-SSCP技術在微生物分類、新種類鑑定、分子流行病學調查中均具有重要作用。

基本介紹

  • 中文名:單鏈構象多態性分析
  • 外文名:single strand conformation polymorphism
  • 簡稱SSCP
  • 主要作用:分子流行病學調查
分析原理,適用領域,鹼基摻入法,試劑準備,操作步驟,注意事項,

分析原理

聚合酶鏈反應-單鏈構象多態性分析(Single Strand Conformation Polymorphism Analysis of Polymerase Chain Reaction Products, PCR-SSCP)是近年來發展起來的一種基因分析方法。
PCR-SSCP分析的基本程式為:首先PCR擴增特定靶序列,然後將擴增產物變性為單鏈,進行非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳。在不含變性劑的中性聚丙烯醯胺凝膠中電泳時,DNA單鏈的遷移率除與DNA鏈的長短有關外,更主要的是取決於DNA單鏈所形成的構象。在非變性條件下,DNA單鏈可自身摺疊形成具有一定空間結構的構象。這種構象由DNA單鏈鹼基決定,其穩定性靠分子內局部順序的相互作用(主要為氫鍵)來維持。相同長度的DNA單鏈其順序不同,甚至單個鹼基不同,所形成的構象不同,電泳遷移率也不同。PCR產物變性後,單鏈產物經中性聚丙烯醯胺凝膠電泳,靶DNA中含單鹼基置換,或數個鹼基插入或缺失等改變時,因遷移率變化會出現泳動變位,從而可將變異DNA與正常DNA區分開。由此可見,PCR-SSCP分析技術是一種DNA單鏈凝膠電泳技術,它根據形成不同構象的等長DNA單鏈在中性聚丙烯醯胺凝膠中的電泳遷移率變化來檢測基因變異。該技術已被廣泛用於癌基因抗癌基因變異的檢測、遺傳病的致病基因分析以及基因診斷、基因製圖等領域。

適用領域


為了高靈敏特異性地顯示SSCP分析結果,現已發展多種PCR-SSCP技術,各有其優勢及適用領域。例如,可以在PCR擴增中用同位素或螢光素等標記引物或核苷,也可以在電泳後用銀染溴化乙錠染色以顯示結果。這裡將重點介紹最常用的放射性同位素PCR-SSCP法。在進行PCR擴增特定靶基因序列時,利用γ-32P-ATP標記引物或直接在PCR反應體系中加入α-32P-dCTP進行PCR擴增,使擴增產物帶有同位素標記物,然後將擴增產物變性為單鏈進行非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳放射自顯影顯示結果。利用引物標記或鹼基摻入法使PCR擴增產物帶有同位素標記物,均可使產物信號增強幾個數量級。二者相比較,前者經濟、擴增特異性強,多用於大樣本的檢測和篩選;後者操作簡便,適於一般實驗室開展,可用於小樣本或大樣本的檢測和篩查。

鹼基摻入法

試劑準備

⒈ PCR相關試劑
⒉ α-32P-dCTP
⒊ 30%聚丙烯醯胺(29:1):丙烯醯胺29g、甲叉雙丙烯醯胺 1g,溶於100ml ddH2O中,4 OC保存。
⒋ 10%過硫酸胺配製方法:1g 過硫酸胺,溶於10ml ddH2O中,4 OC保存(可用數周)。
⒌ TEMED(N,N,N,N’,N’-四甲基乙二胺
⒍ 5×TBE緩衝液:Tris鹼54g、硼酸27.5g、0.5M EDTA(pH 8.0) 20ml,加ddH2O至1000ml。
7.變性上樣液:95% 甲醯胺、0.03%二甲苯青、0.05%溴酚藍、 20mM EDTA(pH 8.0)

操作步驟

反應總體積為10μl,在0.5ml微量離心管中加入下列反應成分:
10×buffer   1μl
dNTPmix   70μM
DNA模板 100ng
引物及Taq DNA酶 依實驗設計要求按比例加入
α-32P-dCTP   0.1μl
加ddH2O至   10μl
按實驗設計循環參數進行擴增,獲取擴增產物。
⒉ 聚丙烯醯胺凝膠電泳
電泳槽玻璃板的處理:用洗滌劑清洗玻璃板,自來水反覆沖淨洗滌劑,雙蒸水沖洗3次,晾乾,95%乙醇擦拭,自然乾燥。用棉簽沾取SigmaCote塗於玻璃的貼膠面上, 5~10min後再用軟紙擦拭除去多餘的SigmaCote溶液。在兩塊玻璃內的兩側放好襯條對齊,用固定夾夾緊兩塊玻璃,並用玻璃膠帶封邊。
⑵ 制膠:按照被分離DNA片段的大小、含量及玻璃板、襯條的大小決定凝膠的濃度與體積,一般來講使用5%~8%的凝膠較為合適。輕輕搖勻配製的膠液於真空抽氣(開始時要緩慢)除氣泡,加 35μl TEMED至聚丙烯醯胺混合液中,混勻。用10ml玻璃吸管或50ml注射器吸取膠液,將玻璃模具傾斜成60O角,緩慢注入兩玻璃板間的空隙中,直至灌滿模具頂部。立即插入相應的點樣梳,(小心勿使梳齒下帶進氣泡,並且不要將梳齒全部插入膠內,留約2mm梳齒於玻璃板上端,以免拔梳時把膠孔拔斷)。由於凝膠在聚合過程中有回縮,所以應小心添加些膠液於梳子處,水平放置,室溫聚合1hr。將封口玻璃膠帶掀去,放入電泳槽,凹型玻璃貼緊電泳緩衝液槽,用大號固定夾固定住兩側。在上下電泳槽內灌入 1×TBE電泳緩衝液。小心取出點樣梳,用槽內的緩衝液反覆沖洗點樣孔,以去除可能存在的未聚合的聚丙烯酸胺和氣泡。
⑶ 擴增產物的處理:將 PCR擴增產物與變性上樣液按1:5的比例加入0.5ml 微量離心管中,混勻。樣品上膠前應98 o C變性10min,立即冰浴驟冷。取約3~5μl變性樣品(根據點樣孔的大小決定上樣量),以微量加樣器上樣,(上樣時要注意不要有氣泡衝散樣品,而且速度要快,時間長了樣品易於擴散)。
⑷ 電泳:電泳槽接上電極(上槽接負極,下槽接正極)開啟電源,根據擴增片段的大小及電泳槽和凝膠的大小,決定電泳的電壓及電泳時間。通常室溫下以l~5V/cm電泳。
⑸ 剝膠:電泳結束後,倒棄電泳緩衝液,取下電泳膠玻璃,用塑膠楔子從玻璃板底部一角小心分開玻璃,凝膠應附著在一塊玻璃上,切去凝膠左上角,作為點樣順序標記。剪一張與玻璃同樣大小的濾紙,嚴密覆蓋於凝膠上,順一個方向將凝膠緩慢取下,用保鮮膜蓋於膠面並包好,避免膜和膠之間產生氣泡或皺摺,將凝膠固定在X線片夾中。
⑹放射自顯影:在暗室中將X線片貼於膠面,蓋嚴片夾,用黑布將X線片夾包裹,置-70OC放射自顯影曝光時間根據同位素的強度而定,約 24h~10d。
⑺ 沖洗膠片從-70oC取出X線片夾,在暗室內迅速取出X線片,立即顯影,以免使X線片上出現過多的冷凝水。(如果想再得到一張放射自顯影影像,可立即在片夾中裝一張新X線片並儘快放回到一70oC繼續顯影。如果來不及再加入新片即已出現冷凝水則應使樣品凝膠和X線片夾都恢復到室溫,並擦去冷凝水後再裝入新的X線片)。依次按以下程式操作進行顯影
X線片顯影液顯影 1-5min
水洗 lmin
定影液定影 5min
流動水沖洗 15min
所有使用液的溫度應為18~20OC為宜。

注意事項


核酸片段的大小: 用於SSCP分析的核酸片段越小,檢測的敏感性越高。對於<200bp的片段,SSCP可發現其中70%的變異;對於300bP左右的片段則只能發現其中50%的變異;而>500bp的片段,則僅能檢出10%~3O%的變異,因此,<300bP,尤其是150bP左右的核酸片段更適於SSCP分析。對於大於400bp的PCR產物就需要設法進一步處理,可以用限制性酶消化PCR產物,產生小於400bP的DNA片段,再進行SSCP分析。
⒉ 游離引物: 游離引物可能同 PCR產物結合而改變其泳動率,即使游離引物量為6nM都有明顯影響。因此,應儘可能除去游離引物。可以採用不對稱引物擴增方法,儘可能消耗多餘的引物。也可以運用過柱或磁性球方法純化PCR產物。或者是稀釋PCR產物,減少游離引物的干擾。
⒊ 低濃度變性劑: 凝膠中加入低濃度的變性劑,如5%-10%甘油、5%尿素甲酸胺、10%二甲亞碸(DMSO)或蔗糖等有助於提高敏感性,可能是因為輕微改變單鏈DNA的構象,增加分子的表面積,降低單鏈DNA的泳動率。但有些變異序列卻只能在沒有甘油的凝膠中被檢出。因此,對同一序列使用2~3種條件做SSCP,可能提高敏感性。
⒋ 電泳溫度: 一般認為保持凝膠內溫度恆定是SSCP分析最關鍵的因素,溫度有可能直接影響DNA分子內部穩定力的形成及其所決定的單鏈構象,從而影響突變的檢出。室溫下電泳適於大多數情況,但由於在電泳時溫度會升高,為確保電泳溫度相對恆定,應採取以下措施:減少凝膠厚度,降低電壓,有效的空氣冷卻或循環水冷卻等。
⒌ 凝膠的長度: 可用測序板進行SSCP分析,凝膠板長度在40cm以上。
⒍ 凝膠濃度及厚度: 凝膠濃度很重要,一般使用5%~8%的凝膠,凝膠濃度不同,突變帶的相對位置也不相同,如果在進行未知突變種類的SSCP分析時,最好採用兩種以上凝膠濃度,這樣可以提高突變種類的檢出率。凝膠的厚度對SSCP分析也很重要,凝膠越厚,背景越深,在上樣量較多的前提下,儘量使凝膠越薄越好。
假陰性: 一般認為,如沒有污染,PCR-SSCP分析不存在假陽性結果,但可能出現假陰性結果,後者是由於點突變引起的空間構象變化甚微,遷移率相差無幾所致,尤其是點突變發生在擴增片段的兩端時。如果有陽性和陰性對照,結果可以重複確定的突變帶是可信的,如果沒有陽性對照,應經測序來確定其是否為突變帶。由於PCR-SSCP的不足之處主要是可能檢出假陰性結果。應通過設定陽性對照,摸索電泳條件,假陰性結果在很大程度上是可以避免的。但對未知基因變異的檢測,假陰性結果就難以百分之百地消除。
8. 結果分析: 單鏈凝膠電泳時,互補單鏈遷移率不同,一般形成兩條單鏈帶。PCR產物進行單鏈凝膠電泳之前,通過加熱變性產生單鏈。如變性不徹底,殘留雙鏈亦可形成一條帶.因此,PCR-SSCP分析結果至少顯示三條帶。但是,由於一種DNA單鏈有時可形成兩種或多種構象,檢出三條或四條單鏈帶就不足為奇。

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