多交點多光子顯微技術（multifocal multiphoton microscopy，MMM）提高了激發光能的利用率和成像速度，可以實現樣品的三維快速多光子激發螢光顯微成像，並且具有對活體樣品損傷小，成像深度大，圖像信噪比高等優點。
基本介紹
- 中文名：多焦點多光子顯微技術
- 外文名：multifocal multiphoton microscopy，MMM
- 專業：顯微技術
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背景引言
螢光顯微技術已經成為生物醫學領域的重要研究工具，雷射掃描共焦顯微(laser scanning confocal microscopy，LSCM）和多光子激發螢光顯微(multiphoton microscopy ，MPM) 技術可用於實現生物樣品的高空間分辨三維成像, 但共有的缺點是要對樣品進行逐點掃描 , 因此成像速度低。
提高多光子激發螢光顯微成像速度的方法之一是提高激發光斑在樣品上的掃描速度 。由於圖像上每一像素點的測量時間減少了, 為了得到足夠的信噪比,需要增加螢光團濃度或激發光束強度等,但這此受到所研究的生物樣品的限制, 過高的螢光團濃度會干擾生物樣品的正常功能, 同時會對樣品 產生毒性。另外, 由於目前大多數多光子激發顯微成像系統採用如檢流計振鏡和共振鏡等機械掃描方式,過分提高掃描速度會嚴重影響到掃描的精度。
另一種提高多光子激發螢光顯微成像速度的方法是利用多個激發光點同時激發樣品， 這樣 , 即使採用傳統的機械掃描方式如檢流計振鏡和Nipkow盤,成像速度也會得到顯著提高 , 不但可以實現生物樣品的實時多光子激發顯微成像, 還可以用眼睛通過目鏡直接觀察 , 這就是多焦點多光子顯微技術(multifocal multiphoton microscopy，MMM )。
多焦點多光子顯微技術
MMM 技術是 20 世紀末發展起來的, 它與單光束雷射掃描顯微鏡相比最大的變化是：（1） 需要一 個光束分離裝置（如右圖）產生多個焦點；（2） 需要一個探測器能夠探測從所有焦點處發出的螢光信號 。MMM採用旋轉微透鏡盤 、微透鏡陣列 、級聯分束鏡 或衍射光學元件將飛秒雷射器輸出的光分成許多子光束 ,經過顯微鏡的中間光學系統和物鏡後聚焦到樣品上 , 產生衍射極限激發光點陣, 實現樣品的多焦點多光子並行激發 ,通過旋轉微透鏡盤或檢流計振鏡掃描子光束來實現這個激發點陣在樣品上的掃描, 同時採用置於系統非解掃通道的面陣 CCD 相機接收樣品的螢光顯微圖像。通過對樣品的多焦點多光子並行激發和探測, MMM 極大提高了成像速度。
光束分離器原理圖
光束分離器原理圖另外, MMM 技術在提高成像速度的同時, 也提高了多光子激發螢光顯微術對光源光能的利用率 ,而這也是傳統的單點掃描多光子激發顯微中存在的一個問題 。多光子激發螢光顯微技術所用光源一般是超短脈衝鎖模雷射器 , 如鈦寶石鎖模飛秒雷射器 ,其所輸出雷射脈衝的平均功率為 1~2 W 而實際上，受樣品非線性損傷的限制, 傳統的單點掃描多光子激發螢光顯微所需的光功率大約為 3~10 mW因此, 對光能的利用率很低。同時, 這種並行的測量過程並沒有顯著影響空間解析度。
多焦點多光子顯微技術進展
生物醫學發展對檢測和成像系統的一個要求是在一次測量中能以很高的靈敏度和特異性得到多種功能信息, 另一個要求是能夠無損、實時監測活體細胞的動態過程 , 這也成 為了螢光顯 微技術不斷發展和進步的源動力 。MMM 在提高激發光能 利用率的同時 , 也提高了成像速度, 從而使實時雙光子激發螢光成像成為可能 。近年來 MMM 在性能改進、技術發展以及與其他相關技術融合方面也取得了非常大的進展。
基於掃描相機的STSR的多焦點多光子顯微術
深圳大學的生物光子學研究小組在國際上首次提出了一種基於高重複頻率皮秒掃描相機的同時時間和光譜分辨的多焦點多光子顯微技術（simultaneous time and spectrum-resolved multifocal multiphoton microscopy，STSR-MMM），該技術可以最大限度地利用每一次雙光子激發所產生的螢光的全部信息，並將不同光譜、不同時刻的信息以高的光譜和時間解析度同時進行記錄。STSR-MMM系統原理如圖1所示。
圖1 STSR-MMM系統原理圖
圖1 STSR-MMM系統原理圖基於TCSPC的多焦點多光子顯微技術
時間相關單光子計數（time-correlated single photon counting，TCSPC）技術可以實現16個通道的光譜分辨螢光壽命成像，一般認為不能用於多焦點測量，但French小組已將TCSPC技術與多焦點多光子顯微技術結合，如圖2所示，它是把原來獲取光譜信息的16個通道PMT陣列用於多焦點的螢光壽命探測，因此失去了光譜分辨功能。與單通道TCSPC FLIM相比，多焦點多光子TCSPC FLIM系統的成像速度明顯提高。
圖2 TCSPC-MMM試驗系統
圖2 TCSPC-MMM試驗系統變視場掃描多焦點多光子顯微技術
一般的MMM系統大都採用用 固定的物鏡和陣列分光元件，而且中間光學系統也是不變的，因此MMM系統通常只具有單一的掃描視場和分辨本領。為了使MMM系統既能工作在低解析度和大視場條件，又能工作在高解析度和小視場條件，同時在兩種情況下又能充分利用系統各個器件的性能，利用振鏡掃描和載物台掃描相結合實現了視場和解析度的自由轉換 , 發展了一種 基於固定光路系統和變視場掃描的多焦點多光子顯微技術，圖3所示為變視場掃描 MMM 實驗系統原理圖 。
圖3 變視場掃描MMM試驗系統原理圖
圖3 變視場掃描MMM試驗系統原理圖基於隨機掃描的多焦點多光子顯微技術
MMM 中由於整個成像視場是由各個焦點的掃描區域拼接組成 , 因此要求掃描精度高，以避免產生“棋盤圖案 ”。 前期報導的多焦點多光子顯微技術均採用基於檢流計振鏡或共振鏡的光柵掃描方式 ，檢流計掃描振 鏡的缺點是速度慢 , 在快速掃描的情況下精度不夠高。 當其套用於 MMM 系統掃描時必須避免在各個小區域邊界 的過取樣或欠取樣 , 以及由此引起的在圖像中產生棋盤圖案。若用計算機控制檢流計振鏡在樣品上 掃描Lissajous圖案, 通過獨立地改變掃描信號的幅度和頻率, 可以實現均勻、連續和快速掃描；用信號發生器產生的模擬白噪聲信號分別獨立地控制x和y掃描振鏡，可以實現均勻和連續的“隨機掃描”。
總結與展望
MMM 能夠提高激發光能利用率和成像速度, 同時具有了 MPM 的所有優點，因此在生物醫學研究領域受到越來越多的關注。
