即時聚合酶鏈鎖反應（Real-time polymerase chain reaction，簡稱 Real-time PCR、即時PCR），又稱定量即時聚合酶鏈鎖反應（Quantitative real time polymerase chain reaction，簡稱 Q-PCR/qPCR/qrt-PCR、定量即時PCR、即時定量PCR），是一種在DNA擴增反應中，以螢光染劑偵測每次聚合酶鏈鎖反應（PCR）循環後產物總量的方法。
基本介紹
- 中文名：即時聚合酶鏈鎖反應
- 外文名：Real-time polymerase chain reaction
- 對應：定量即時聚合酶鏈鎖反應
- 簡稱 ：Real-time PCR、即時PCR
概述,染劑,儀器,數據分析,套用,優點,
概述
定量即時PCR及定量反轉錄PCR（quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR）已被眾多科學家採用，因為其偵測範圍廣、靈敏度高、準確、專一及快速。qPCR的發展因為偵測感染病患的病毒或細菌量、癌症監測、診斷個別基因差異的用藥反應等套用而大幅提高。
qPCR的方法是基於偵測目標物在反應前及PCR後產物的量化關係。相對於終端PCR方式（end-point PCR，傳統的PCR配合凝膠電泳，在反應後偵測）qPCR有許多優點。其結果可以較快取得且穩定，因為是採用非常敏感的化學螢光，而且不需要在PCR反應後的偵測步驟。此外，因為反應後不需打開管子而減少了操作污染。qPCR分析亦適於更具挑戰性的套用，如多重偵測與高通量分析。
染劑
使用於qPCR偵測的化學物基本可分為兩類：非專一性化學物通常是與DNA結合的螢光染劑；目標專一性化學物是使用螢光探針或引子。
非專一性偵測：SybrGreen、HRM(High Resolution Melt)
目標專一性偵測：TaqMan probe、Molecular Beacon、LightUp、FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)
儀器
光源：氙氣燈、雷射、發光二極體（LED） 濾鏡
偵測方式：光電倍增管（photomultiplier tube, PMT）、光電耦合元件（charge-coupled device, CCD）、光電二極體（photodiodes）
控溫方式：熱電效應元件（peltier elements）、旋轉式氣流升降溫、微流體式
容器：聚丙烯（PP）容器、玻璃毛細管
數據分析
門檻循環（Threshold cycle, Ct或稱閾值）
解離曲線分析（melting curve）
高解析度解離分析（High Resolution Melt, HRM）
FRET分析
套用
基因表現分析、檢驗生物晶片的結果、siRNA與miRNA、診斷、基因型鑑定
優點
螢光實時定量PCR的基本原理有兩個要點：首先是對PCR反應中的每一個循環的反應產物進行實時檢測並記錄下來；其次，用於檢測PCR產物實時檢測的螢光染料標記在一段可以與單鏈PCR產物(模板)特異性雜交的探針上，並且處於淬滅狀態，只有當探針與模板特異性結合以後才有可能釋放出螢光信號，要實現這一點可以有以下兩種方法：一是選取PCR上下游引物之間的一段序列作為探針，並在探針的5`-端標記上螢光基團，3`-端標記上相應的淬滅基團(由於兩個基團靠得很近，構成螢光能量傳遞的關係，沒有螢光信號產生，在每一個循環的退火過程中，該探針可以與模板相結合，隨後的延伸反應中，當引物合成至探針與模板結合處時，Taq酶的5`-外切酶活性可以降解探針的5`-端，並因此使螢光基團與淬滅基團分離，釋放螢光，理論上每合成一次新鏈就有一次螢光信號釋放)；二是探針片段在游離狀態下呈莖襻(stem-loop)結構，其中莖的部分一般是5至7個高GC含量的核苷酸，襻的部分是15至30個可以與PCR模板互補的核苷酸序列，而且探針的5`-端和3`-端分別標記有螢光報告基團和淬滅基團(由於這兩個基團處於莖的結構中，靠得很近，沒有螢光信號產生，在PCR每一個循環的變性過程中，處於莖襻結構的探針被打開，並在退火過程中與模板結合，使報告基因遠離淬滅基團並釋放螢光信號，因而螢光強度與被擴增的模板量成正比)。
無論哪種方法，每一輪循環中PCR的產出量都以螢光信號的形式被PCR儀的光學檢測系統記錄下來，在某一循環中螢光信號的強度達到預先設定的閾值時，此時的循環書稱為CT(Threshold Cycle)，CT值與起始的模板量成反比(起始的PCR模板量越多，達到閾值的循環數即CT值越小)。如果要確定量的話，需要做出標準曲線，以CT值為縱坐標，起始模板數為橫坐標作圖。
常規PCR的產物在理論上呈指數級增長，而在實際反應中，由於底物濃度、酶活性等條件的變化，在循環數不斷增加時，反應進入平台期，PCR產物不再呈指數級增長。螢光實時定量PCR的優點在於它避免了常規PCR的平台效應對起始模板量和最終產物量之間相關性的干擾。它的另一個優點是只有正確的擴增產物才能和用於定量的探針結合併產生螢光信號，這樣就避免了假陽性污染，對於臨床診斷等工作特別有效。
