聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）又稱“體外的基因擴增”是由美國某公司和加利福尼亞大學於1985年共同合作開發的一項基因工程技術。這一技術可以在幾個小時內將pg（10-9g）水平的單鏈拷貝序列擴增至上百萬倍，已廣泛的在於多領域得到了套用[1]。近些年來，PCR技術得到了不斷的完善，並衍生出了多種PCR技術（如反向PCR、多重PCR等技術）以及與PCR技術相關聯的其它新技術（如RAPD、AFLP等分子標記技術）。
基本介紹
- 中文名：多聚合酶鏈式反應
- 外文名：polymerase chain reaction
- 簡稱：PCR
- 又稱：體外的基因擴增
技術原理,反應過程,主要成分,基本操作,
技術原理
PCR的基本原理是利用聚合酶依賴於模板的特徵，在體外模仿體內天然的DNA複製過程。複製過程被限定在一對人工合成的寡核苷酸之間。這段寡核苷酸被稱為“引物”，長度通常為20個核苷酸。
反應過程
PCR反應主要包括三個步驟：（1）DNA變性，它是加熱使模板DNA雙鏈解離，形成兩條單鏈的過程；（2）引物退火，即將反應溫度降低，使兩個引物分別與變性的兩條模板DNA單鏈的3’—端配對，這一過程也被稱為復性；（3）延伸，在四種脫氧三磷酸核苷存在的條件下，由DNA多聚酶催化，使引物沿模板DNA單鏈的3’→5’方向延伸，合成出一條新的DNA鏈。
主要成分
（1）寡聚核苷酸引物；（2）DNA模板；（3）dNTPs；（4）聚合酶（關鍵性試劑）。
基本操作
（1）依次在滅菌的微量塑膠管中加入下列溶液，混勻後待用。
滅菌去離子蒸餾水 30μL
10倍擴增緩衝液 10μL
四種dNTPs溶液（1.25mmol/L/每種） 16μL
引物1（100pmol，溶於去離子水） 5μL
引物2（100pmol，溶於去離子水） 5μL
模板DNA（根據濃度取不同的量，一般為2μg）
補加去離子水至終體積為100μL
（2）94℃加熱5min，使模板DNA完全變性，立即加入0.5μL Taq DNA聚合酶（4μg/μL～5μg/μL），充分混勻後，加入100μL輕型礦物油或液體石蠟將液面封閉，防止蒸發。
（3）按下表程式，進行擴增。
循 環 變性（94℃） 復性（50℃） 引物延伸（72℃）
第一次循環 5 min 2 min 3 min
中間循環
（25次～30次） 1 min 2 min 3 min
最後一次循環 1 min 2 min 10 min
（4）取出部分擴增後的DNA進行電泳分析，確定DNA的量及純度。
（5）為去除油或液體石蠟的污染，需對樣品進行重新提取。
